不同酵母发酵的青梅酒抗氧化及有机酸的研究

陈铭中，吴海珍，刘志芳，陈勇，钟旭美

阳江职业技术学院食品与环境工程系（阳江 529566）

青梅又称果梅、酸梅，属于蔷薇科，是一种营养丰富，具有多重保健功能的水果，是一种酿造果酒的优质原料[1]。青梅果肉富含多种维生素、17种氨基酸、柠檬酸、酒石酸以及谷甾醇、黄酮类多种保健营养成分[2]。青梅是典型的强生理碱性食品，能中和酸性食物，具有生津止渴、增进食欲、杀菌解毒、净化血液、预防高血压、脑溢血及抑制多种肿瘤等功效[3]，还有研究发现青梅及其制品有具有缓解、消除疲劳、防老抗衰、美容养颜的功效[4]。青梅中含有丰富有机酸，其中柠檬酸是促进人体细胞代谢必不可少的酸，它能促进乳酸分解为二氧化碳和水排出体外[5]，对人体保持体力具有重大意义。青梅保健功能强以及营养丰富，其果酒制品一直深受人们青睐，以青梅汁为原料，经酵母发酵得到一种低酒精度的果酒，是适合于广大人群饮用的饮品。蓝莓果酒、山楂果酒等果酒的活性成分多数以有机酸、黄酮类化合物以及清除自由基作为果酒主要功效成分考察指标[6]。饶炎炎等[7]通过研究红树莓发酵阶段有机酸、活性成分和香气的动态变化作为红树莓的功效评价指标，而青梅酒的功效成分以有机酸、黄酮类化合物及清除自由基报道甚少。此次试验充分利用阳江市阳春地区的特色农产品青梅酿造出的青梅酒，对不同酵母发酵的青梅酒进行成分和抗氧性评价，得出合适于青梅发酵的酵母，为青梅的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青梅，阳江市阳春地区果园；青梅酒，食品加工实验室发酵的青梅酒。

1, 1-二苯基-2-3硝基苯肼（DPPH），福州飞净生物科技有限公司；芦丁、2, 2-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）、2, 4, 6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、硫酸亚铁、三氯化铁，上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化氢、硝酸铝、无水乙醇、乙酸钠、过硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸，广州化学试剂厂；草酸、酒石酸、莽草酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸，均为AR级，上海麦克林生化科技有限公司；甲醇，色谱纯，星马克科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

I3紫外可见分光光度计，济南海能仪器有限公司；FA224电子天平，上海舜宇恒平科技仪器有限公司；恒温水溶锅，上海精宏实验设备有限公司；TGL-18台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；KQ-250E超声清洗器，昆明市超声仪器有限公司；1200高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；PHS-3F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FBZ1002-UP-P超纯水机，青岛富勒姆科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青梅酒样品

青梅酒样品是根据实验室前期研究优化的发酵条件和选择的酵母而发酵得到4种不同的青梅果酒A、B、C、D[8]，其中果酒A为安琪RW酵母发酵的青梅果酒，果酒B为帝伯仕RC212酵母发酵的青梅果酒，果酒C为安琪RW酵母和EC118酵母混合发酵（比例是1∶1）的青梅果酒，果酒D为帝伯仕RC212酵母和D254酵母混合发酵（比例是1∶1）的青梅果酒。

1.3.2 4种青梅酒总黄酮含量的测定

1) 芦丁标准曲线的绘制[9-11]

称取29.8 mg芦丁标准品，用适量的60%乙醇溶液将其溶解，定容至100 mL容量瓶。取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00和6.00 mL芦丁标准液于25 mL比色管中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置；加入1 mL 10%的硝酸铝溶液，摇匀，静置；先加入10 mL 4%的氢氧化钠溶液，再加入60%的乙醇溶液定容至刻度，静置显色10 min。用分光光度计在510 nm处分别测定其吸光度，空白试剂作参比，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，制作标准曲线，得到回归方程。

2) 总黄酮含量的计算

各取2 mL 4种不同酵母发酵的青梅酒于25 mL比色管中，按标准曲线相同操作，得出不同酵母发酵的青梅酒的吸光度，利用回归方程和吸光度计算青梅酒中总黄酮的含量（以芦丁计）。

1.3.3 4种青梅酒抗氧化活性的测定

1) DPPH自由基清除能力的测定[12-13]

各取0.1 mL 4种不同酵母发酵的青梅酒加入到25 mL比色管中，然后向每管中加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀避光37 ℃，水浴1 h后在517 nm下测定吸光度，以无水乙醇做空白对照。

式中：Ab为空白对照管的吸光度；As为样品测定管的吸光度。

2) ABTS+自由基清除能力的测定[14-15]

配制ABTS+储备液：配制2.45 mmol/L过硫酸钾，用过硫酸钾溶解ABTS+，配成7 mmol/L ABTS+储备液，在室温、避光条件下静置12～16 h，储备液可稳定3～4 d。配制ABTS+测定液：以磷酸缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4）稀释，使其吸光度在734 nm波长达到0.700±0.020。测定：取4 mL ABTS+测定液，加入60 μL样品待测液，振荡30 s，反应一定时间后测定在734 nm波长处的吸光度，根据式（2）计算ABTS+自由基清除率。

式中：A样品为样品在734 nm波长处的吸光度。

3) FRAP自由基清除能力测定[15]

取30 μL样品溶液加入900 μL FRAP工作液，定容至10 mL，混匀，在37 ℃的水溶10 min，于593 nm波长出测其吸光度。其中FRAP工作液由20 mmol/L TPTZ溶液（用40 mmol/L的HCl溶液配制）、20 mmol/L的FeCl3·6H2O溶液、0.3 mol/L pH 3.6乙酸钠缓冲液，按10∶1∶1的体积比混合组成（现配现用）。同样，按照上述方法，以0.1～2.0 mmol/L的FeSO4的标准溶液代替样品绘制标准曲线。

1.3.4 4种青梅酒有机酸测定[16-17]

测定条件：色谱柱Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相0.5% KH2PO4水溶液，用H3PO4调节pH 2.6，使用前经0.22 μm微孔滤膜减压过滤；流速0.4 mL/min；柱温20 ℃；UVD检测器；检测波长214 nm，进样量20 μL；标准品和样品溶液用前均经0.22 μ m微孔滤膜过滤。

1) 有机酸标准液的测定[18]

分别准确称取50.0 mg草酸、酒石酸、莽草酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸，用去离子水定容至10 mL，配成5 g/L标准液，为有机酸的混合标准液。经0.22 μL微孔滤膜过滤后进行HPLC测定。

2) 样液的测定

分别吸取5.0 mL 4种不酵母发酵的青梅酒，以11 000 r/min离心15 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC测定[19]。按外标法以峰面积计算青梅酒有机酸的含量。

式中：Cx为青梅酒有机酸的质量浓度，g/L；Ax为青梅酒有机酸的峰面积；CS为有机酸标准液的质量浓度，g/L；AS为有机酸标准液的峰面积。

1.4 数据处理与分析

试验做3次平行测定，结果以均值±标准误差的形式表示，数据采用Origin Pro 2019b绘图，SPSS 21统计软件进行方差分析和显著性检验（Duncan，p＜0.05）[20]。

2 结果与分析

2.1 4种青梅酒总黄酮含量的测定

2.1.1 芦丁标准曲线

由图1可知，芦丁标准曲线的标准方差为y=0.373 2x-0.002 6，相关系数R2=0.999 9，结果表明在一定质量范围内，芦丁质量浓度与吸光度间有很好的相关性。

图1 芦丁标准曲线

2.1.2 不同酵母发酵的青梅酒总黄酮含量比较

由图2可知，不同酵母发酵的青梅酒总黄酮含量不一样，果酒A（安琪RW酵母）与果酒D（帝伯仕RC212、D254酵母）的总黄酮含量较高，抗氧化能力较强[21]。不同酵母发酵的青梅酒总黄酮含量从高到低顺序为果酒D＞果酒A＞果酒C＞果酒B。通过显著性差异分析，果酒A与果酒D总黄酮含量差异不显著，果酒B与果酒C总黄酮含量差异不显著，果酒A与果酒B、C总黄酮含量显著差异，果酒D与果酒B、C总黄酮含量差异显著，这表明酵母类型对青梅酒的总黄酮含量有一定的影响，其中使用安琪RW酵母发酵或帝伯仕RC212、D254酵母混合发酵能使青梅酒具有较高的总黄酮含量。

图2 不同酵母发酵的青梅酒总黄酮含量比较

2.2 4种青梅酒抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

由图3可知，不同酵母发酵的青梅酒的DPPH自由基清除率均较高，其强弱顺序为果酒A（87.1%）＞果酒B（85.2%）＞果酒D（84.3%）＞果酒C（73.8%），并且果酒A、B、D的DPPH自由基清除率均高于80%，而果酒C的DPPH自由基清除率低于75%，果酒A与果酒B、C、D的DPPH清除能力差异显著，果酒B与果酒C的DPPH清除能力差异显著，果酒B与果酒D的DPPH清除能力差异不显著，表明不同酵母对青梅酒的DPPH清除能力有很大的影响，而DPPH被广泛应用于测定自由基的清除能力[22]，使用安琪RW酵母、帝伯仕RC212酵母和混合酵母（帝伯仕RC212+D254酵母）发酵得到的青梅酒均具有较高DPPH清除能力，而安琪RW、EC118酵母混合发酵得到的青梅酒的DPPH清除能力相对低。

图3 不同酵母对青梅酒DPPH清除率的影响

2.2.2 ABTS自由基能力

由图4可知，4种青梅酒均具有一定的ABTS+自由基清除率能力，它们的清除率大小依次为果酒D（71.74%）＞果酒C（70.11%）＞果酒A（69.33%）＞ 帝伯仕（66.86%），但它们的清除率没有显著差异，表明4种果酒ABTS+清除率相当，而果酒D的清除率最大。

图4 不同酵母对青梅酒ABTS自由基清除率的影响

2.2.3 FRAP自由基清除能力

由图5可知，FeSO4在浓度0～2.0 mmol/L范围内与其在593 nm处的吸光度呈现良好的线性关系，其标准曲线方程为y=0.079 7x-0.001 7，相关系数R2=0.999 0。

由图6可知，4种酵母发酵的青梅酒FRAP值均大于0.085 mmol/L，同时有较大差异，FRAP值依次为果酒D＞果酒A＞果酒C＞果酒B，果酒D的FRAP值最高，达到0.094 mmol/L，果酒D与果酒A无显著性差异，但与果酒B、C差异显著；有研究表明抗氧化活性与样品浓度呈现一定的剂量效应[23]，不同酵母发酵的青梅酒FRAP自由基清除能力会有差异，图6表明果酒D（帝伯仕RC212、D254酵母）混合发酵的FRAP自由基清除能力最强。

图5 FeSO4的标准曲线

图6 不同酵母对青梅酒FRAP值的影响

2.3 4种青梅酒有机酸分析

由图7可知，在参照文献[9-10]的色谱条件略作修改后，青梅酒的有机酸能实现较好分离，表明确定的色谱条件适合4种青梅酒有机酸的分析。不同酵母青梅酒有机酸的含量见表1。4种青梅酒有机酸的含量除了果酒A存在苹果酸含量最高外，从高到低顺序趋势大致为柠檬酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、抗坏血酸，4种不同酵母发酵的青梅果酒柠檬酸含量均在7 g/L以上，其中果酒A的苹果酸含量为11.813 g/L、果酒D的苹果酸含量为7.104 g/L，不同果酒相同的有机酸基本存在显著差异，可知4种果酒有机酸在不同酵母发酵条件下，4种青梅酒有机酸酸的含量有很大区别。果酒A中的乙酸、酒石酸没有检测到，果酒C中的乙酸、抗坏血酸也没有检测到，果酒A跟果酒D苹果酸含量比较多，说明在不同的酵母发酵条件下，有一些有机酸可能由于发酵过程中酵母菌的代谢能力产生苹果酸、乳酸、乙酸的功能以及发酵过程中部分乙酸、莽草酸、酒石酸可能发生了降解[12]，验证了果酒中的有机酸除来源于果酒酿造原料外，还会在果酒酿造过程中由微生物代谢产生[24]。果酒B与果酒D有机酸种类含量较多，全部有机酸都可检测到，而果酒B跟果酒D都有帝伯仕RC212酵母参与发酵，总体说明不同酵母对青梅酒有机酸含量的影响很大。果酒D中的8种有机酸均有检出，与其他3种果酒有机酸大致差异均显著，各类有机酸含量均偏高，其中柠檬酸、草酸、莽草酸含量是4种不同酵母青梅酒中最高的，因此可知帝伯仕RC212、D254酵母混合发酵的青梅酒有机酸含量最丰富。从保健的角度看，应选择帝伯仕RC212、D254酵母混合发酵果酒更好，而且4种果酒中柠檬酸的含量均非常丰富，柠檬酸具有较强的保健作用，能促进人体内的乳酸分解、解除疲劳、抗衰老，并且能提高食欲、预防疾病等[11]，因此青梅酒的保健功效强。

图7 有机酸混合标液的液相色谱图

表1 不同酵母发酵的青梅酒有机酸含量 g/L

3 结论

此次试验研究了青梅酒的抗氧化能力和有机酸两方面。对4种不同酵母发酵的青梅酒进行总黄酮含量、抗氧化能力和有机酸分析，结果显示，不同酵母发酵的青梅抗氧化活性成分不同，有机酸的种类和含量均有区别，果酒中的有机酸的含量除了受原料、发酵条件的影响，同时还受不同酵母的影响。综合几个指标分析，帝伯仕RC212、D254酵母混合发酵得到的果酒D的总黄酮含量、ABTS+清除率、FRAP值均是4种果酒中最高的，同时该酒中有机酸种类和含量均相对均衡，对降低血脂、补充能量、缓解疲劳有一定的促进作用。因此，帝伯仕RC212、D254酵母混合发酵菌种可作为青梅酒开发的一种参考菌种。