西洋参超微粉制备工艺及药效评价

2020-12-01赵文英郝豪奇肖薇朱庆书

食品工业 2020年11期

赵文英，郝豪奇，肖薇，朱庆书

1. 青岛科技大学化工学院（青岛 266042）；2. 青岛科技大学高密校区（潍坊 261500）

西洋参为五加科植物西洋参（Panax quinquefoliumL.）的干燥根，研究发现西洋参含有皂苷、脂肪酸、多糖、氨基酸、甾醇、黄酮、挥发油及人体必需微量元素[1]等多种活性成分。传统医学认为其具有补气养阴，清热生津的功效；现代药理试验证明，西洋参有耐缺氧、抗疲劳、免疫增强、抗氧化、抗肿瘤等作用，因此西洋参为临床上常用的滋补类中药。为减少药效成分损失，临床上通常是将西洋参粉碎成细粉后直接入药。但采用传统粉碎技术制备的西洋参细粉，粒径通常在80～100目之间（即150 μm左右），服用时药效成分溶出不完全，药材利用率并没有明显提升。

超微粉碎技术是在粉体学的基础上，利用机械或流体力学方法，将固体物料粉碎至微米级甚至纳米级微粉的技术[2]。与传统粉碎技术相比，超微粉产品具有更大的表面积和孔隙率，很好的溶解性，很强的吸附性、流动性，以及化学反应速度快等一系列特殊的物理化学性质。国内外已广泛应用于陶瓷、食品、医药、纺织、化妆品及航空航天等领域[3]。

超微粉碎技术应用于中药产业最早集中于雄黄、石膏等矿物药，以增加它们的溶解率，提高疗效[4]。近年来，基于破坏植物细胞壁，促进植物细胞内成分溶解、扩散等原理的超微粉技术在植物类中药加工中的应用研究日趋增多，如鞠爱华等[5]研究栀子超微粉与普通粉的指纹图谱，发现超微粉碎不改变化学成分的类型，但主要化学成分含量会增加，却未对成分活性进行深入探讨。Choi等[6]研究超微粉碎对当归药效的影响，发现超微粉碎可提高其加工、储存及服用过程中稳定性，而未对其机理进行深入探讨。Zhi等[7]对比大鼠口服丹参超微粉与饮片提取物后体内成分变化，发现超微粉可提高有效成分吸收率与利用度；而Wang等[8]对丹参超微粉治疗心肌梗塞作用研究，发现相同剂量下超微粉疗效比传统丹参提取物的作用更显著，也从另一个侧面反映出超微粉碎能提高有效成分的生物利用度。这些研究从不同角度证实，超微粉碎技术应用于中药加工具有显著的改善中药材生物利用度，增强药效的作用。近几年，超微粉碎技术应用于西洋参等贵细药材的加工，并开展相关研究。Chen[9]与徐浩淇等[10]研究粉体粒径对西洋参中皂苷成分溶出度的影响，通过体外溶出度研究证明，西洋参破壁饮片化后能够改善其有效成分的溶出效率，但对其药效的影响没有进行研究。侯集瑞等[11]对不同粒径西洋参的药效进行初步比较研究，发现其微米级超微粉的药效随着粒径的减少而有所增强，但药效增强作用与其有效成分释放量变化是否相关没有进行深入探究。试验通过对比西洋参超微粉和普通粉在药效方面的变化，并进一步进行透皮研究，从药动学角度初步探究西洋参超微粉药效增强作用机制，为西洋参等名贵中药材加工提供依据和方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

剪切式粉碎机（郑州攀奇机械设备有限公司）；行星式球磨机（长沙天创粉末技术有限公司）；粒径分析仪（德国新帕泰克有限公司）；超声清洗仪（江宁万和超声电子设备有限公司）；紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；透皮吸收仪（配Franz扩散池，上海玉研科学仪器有限公司）；721分光光度计（河北润联科技开发有限公司）。

羧甲基纤维素钠（AR，天津市大茂化学试剂厂）；甘油、香草醛、高氯酸、冰醋酸（AR，国药集团化学试剂有限公司）；西洋参（青岛古城中药房）；心得安（青岛国风药业股份有限公司）；小鼠（高校医用实验动物中心）；猪肠衣（市售）。

1.2 西洋参超微粉制备工艺考察

1.2.1 西洋参超微粉制备工艺影响因素考察

取预先加工干燥后的西洋参普通粉（过120目标准筛），在行星球磨机中进行超微粉碎。以粒径为指标，分别考察球料质量比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1）、大小球数比（5∶15，5∶20，5∶25，5∶30和5∶35）、转速（150，200，250，300和350 r/min）、时间（5，10，15，20和25 min）4个因素对西洋参粉末粒径影响。

1.2.2 正交试验设计

在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对超微粉粒径的影响，以球料质量比、大小球数比、转速、时间比为主要影响因素，按L9(34)因素水平采用正交设计[12]考察制备西洋参超微粉制备的最佳工艺。因素水平表见表1。

表1 因素水平表

1.3 西洋参超微粉体外抗氧化作用考察

1.3.1 DPPH·清除试验

参考文献[13]方法，取西洋参超微粉，以甲醇为溶剂提取，离心后得到上清液，普通粉同法提取作为对照。取1.25 mL上清液加入2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液，避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度Ai。甲醇代替上清液吸光度为A0，甲醇代替DPPH测得吸光度Aj。

式中：A0为未加样品溶液时DPPH溶液的吸光度；Ai为加入样品溶液时DPPH溶液的吸光度；Aj为未加DPPH溶液时样品溶液的吸光度。

1.3.2 ·OH清除试验

参考文献[14]方法依次向10 mL试管中依次加入样品溶液，新制的9 mmol/L FeSO4溶液，6 mmol/L H2O2溶液各1 mL，摇匀，静置10 min后加入9 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL，摇匀，37 ℃水浴30 min，以70%乙醇为参比溶液，于517 nm处测定吸光度Ai，用水代替水杨酸测定吸光度Aj，用甲醇代替样品溶液测定吸光度A0，同条件下平行操作3次。

式中：A0为未加样品溶液的吸光度；Ai为加入样品溶液的吸光度；Aj为加入水杨酸溶液的吸光度。

1.4 西洋参超微粉体内药效评价

1.4.1 小鼠耐缺氧试验研究

取昆明种小鼠80只，随机分为8组，分为心得安阳性对照组（0.25 mg/mL），空白对照组（生理盐水），超微粉和普通粉的低（0.025 g/mL）、中（0.05 g/mL）、高浓度（0.075 g/mL）组[15]。灌胃给药，30 min后将小鼠放入盛有15 g钠石灰的250 mL广口瓶中，盖严，使之不漏气，开始计时，观察并记录小鼠因缺氧而窒息死亡的时间[16]。

1.4.2 小鼠抗疲劳及免疫增强试验研究

取昆明种小鼠80只，随机分为8组，分组及给药剂量同1.4.1。每组小鼠单独喂养，连续灌胃给药1周，保证足够的水和食物。每天抓摸动物5～10 min，使动物适应试验过程中的抓摸触碰。试验前观察小鼠各方面活动，待小鼠活动趋于平稳后开始试验。将各组小鼠分别放入游泳箱中，尾部负5%重物，保证游泳箱中水深不低于30 cm，水温维持室温约20 ℃。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间[17]。结束一组小鼠试验后换水，以消除前组小鼠气味对后组小鼠的行为的影响。在小鼠死亡后肢体未僵硬之前将小鼠解剖，记录每只小鼠体重及脾重[18]。

1.5 西洋参超微粉体外透皮吸收研究

参照文献[19]，以齐墩果酸为标准品，按照常规方法制备标准曲线，在0.2～1.8 mg/mL范围内标准曲线y=3.180 1x+0.057 9（r=0.999 6）。

参照文献[20]方法，取市售猪肠衣，洗净，剪成合适大小，固定于Franz扩散池中间，使内侧朝向接收池，将Franz扩散池编号1～2，供给池加入用羧甲基纤维素钠、甘油及普通粉或超微粉制成凝胶，接收池中加入生理盐水至刻线，37±0.5 ℃恒温水浴，300 r/min恒速磁力搅拌。开始计时后，于12 h内分段取样。样品置于试管中，于560 nm波长处测定吸光度，由标准曲线计算累计释放量。以累计浓度为纵坐标，时间为横坐标，绘制曲线。

1.6 统计学分析

数据用Excel建立数据库，采用SPSS 21.0统计软件进行处理，按LSD检验法进行多重比较，p＜0.05为差异有统计学显著意义。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

如图1（a）所示，球料质量比为40∶1时物料粒径最小。这是因为球料质量比太大时，研磨介质间以及介质和衬板间冲击摩擦损失的无用功增加[21]，金属消耗增加，使研磨效率降低；球料质量比太小时，物料的缓冲作用增加，研磨效果也会减弱，因此选定40∶1为最佳球料质量比；由图1（b）可知，随着球磨机大小球比增大，粉体的粒径呈现先减小后增大趋势，这是因为在球磨物料时，大球能量高对大颗粒物料作用强，小球填充于大球空隙间，对于粗细不同的物料产生作用，如果大球数过多，物料大颗粒易被粉碎，但缺乏进一步的研细，物料平均粒径会较大；小球数过多，会阻碍大球对物料的冲击粉碎，同时球与物料的总质量超出球磨罐有效负荷，球与物料有效接触机会下降，粉碎效果也会变差，因此选定5∶20为最佳配比；从图1（c）可知，随着行星式球磨机转速增加，西洋参粉体粒径逐渐变小，是因为西洋参与粉碎介质接触增加，药材不断被机器研磨的力度增大，考虑到设备机身承受能力，并且在400 r/min时粒径减少不明显，因此选定300 r/min作为最佳转速；图1（d）显示粉碎时间对粒径的影响呈现先快速降低，随后缓慢增加趋势，随着粉碎时间[22]延长，小粒径的西洋参粉体增多，粉碎难度增大，因此粉碎细度增加缓慢，同时由于设备工作散热，西洋参细粉含多糖较多，自身黏度较高，使粉体出现团聚现象，粒径反而会有所增大，因此粉碎时间在15 min最佳。

2.2 西洋参超微粉制备工艺优化

根据表1因素水平设定条件进行试验，利用粒径分析仪测得西洋参纳米颗粒的粒径的大小，结果见表2。极差的大小顺序为C（转速）＞A（球料质量比）＞B（大、小球数比）＞D（时间），转速与球料比为粒径主要影响因素，大小球的比例与时间为次要因素。

通过极差分析所得最佳组合为A3B3C1D2，为进一步验证正交试验结果，进行3次平行试验，粉体平均粒径483.2 nm，小于正交表中最小粒径530.7 nm；因此，制备西洋参超微粉最佳条件为球料质量比50∶1，大小球数比5∶20，转速250 r/min，转动时间15 min。超微粉粒径分布如图2所示，粒径分布范围在400～780 nm之间，属于纳米级超微粉范围。

图1 超微粉碎单因素结果

表2 正交法优化西洋参超微粉制备工艺结果

图2 西洋参超微粉最佳工艺粒径分布

2.3 体外抗氧化试验

DPPH·清除试验与·OH清除试验结果表明（见表3），体外西洋参超微粉抗氧化活性略低于普通粉。杨丽等[23]在进行葡萄籽超微粉抗氧化活性研究发现，随着超微粉粒径减少，DPPH·和·OH清除能力均呈现下降趋势，该研究与本试验结果相似。这可能是由于机械粉碎过程中产生了能量积聚，破坏药材中对热比较敏感的抗氧化活性成分，使其抗氧化能力降低。另外，超微粉中有效成分缺乏细胞壁的保护，更易受外界环境中的光、热等因素的影响，因此加工过的超微粉如果没有及时处理或保管不当，其抗氧化活性也容易降低。

表3 超微粉DPPH·与·OH清除率

2.4 体内药效学结果分析

2.4.1 西洋参超微粉耐缺氧作用

由图3所示，西洋参超微粉组及普通粉组的耐缺氧时间均比生理盐水组的长，并且同一粒径下中剂量组相较于高、低剂量组的提高耐缺氧作用更明显；各浓度下超微粉组小鼠的存活时间整体长于普通粉组，说明西洋参的提升耐缺氧能力受给药浓度和药粉粒径影响。但按LSD检验法进行多重比较，只有超微粉中浓度组相比于空白对照有明显的增强耐缺氧能力，并且超微粉中浓度组与心得安组存在显著性差异，说明西洋参经超微粉碎加工后可显著增强小鼠耐缺氧能力，但增强作用弱于临床常用药心得安。

2.4.2 西洋参超微粉抗疲劳及免疫增强作用

由图4可知，西洋参普通粉组与超微粉组小鼠的游泳时间均长于生理盐水，并且低剂量组延长作用更明显；各浓度下超微粉组小鼠的游泳时间均长于普通粉组。说明西洋参的抗疲劳作用受给药浓度和药粉粒径影响。按LSD检验法进行多重比较，普通粉低剂量组和超微粉中低剂量组相较于空白对照组提升抗疲劳能力均具有差异显著性，尤其是超微粉低剂量组相较于阳性对照组（心得安组）和普通粉低剂量组具有更显著地提升抗疲劳能力，说明超微粉碎可显著增强西洋参的生物活性。

如图5所示，西洋参普通粉组与超微粉组小鼠的脾重指数均大于生理盐水，并且中剂量给药组作用更明显，说明西洋参具有免疫增强作用，且有浓度相关性。按LSD检验法进行多重比较，心得安组、普通粉中浓度组、超微粉中低浓度组与生理盐水组的免疫增强作用存在差异显著性；超微粉组小鼠的脾重指数整体大于普通粉组，说明超微粉碎具有增强药效的作用，但增强作用差异没有显著性。

图3 药物对耐缺氧能力的影响

图4 药物对游泳时间的影响

图5 西洋参超微粉碎后对脾重指数的影响

2.5 西洋参超微粉体外透皮吸收结果

从图6曲线可以看出，西洋参中皂苷类成分透过量随着时间延长呈现均匀增长，且超微粉透过量始终高于普通粉。目前普遍认为[24]，中药材经超微粉碎后使细胞破壁率提高，有效成分溶出度增加[25]，同时因为粒径显著减小，比表面积增加，药粉更易吸附于胃肠壁，也有助于药效成分经生物膜的跨膜转运。因此超微粉碎技术可通过增加中药材中有效成分在胃肠道的吸收而提高药效。