南极磷虾肽的脱氟工艺和体外抗氧化作用

方磊，王雨辰，张海欣，马勇，谷瑞增，陈亮

中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心（北京 100015）

生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，又称功能肽。功能肽一般是由相应的蛋白通过酶解制得，通常含有3～20个氨基酸残基，它在原蛋白质序列上没有生物活性，但是通过酸、碱或酶水解释放后具有生物活性，其活性取决于它们的氨基酸组成及其排列顺序[1]。据报道已经开发出多种具有抗氧化、降血压、免疫调节等生物活性肽[2-4]，在食品、医药领域展现出极好的应用前景。南极磷虾（Euphausia superba），又名大磷虾或南极大磷虾，是一种生活在南冰洋的南极洲水域的磷虾。南极磷虾是世界上生物量最大的多细胞生物，据统计南极磷虾资源的生物量保守估算有6.5亿～10亿 t，每年的可捕量为6 500万～1亿 t，等同于全球1年的总海洋捕捞产量[5]。南极磷虾含有丰富的蛋白质，其干基蛋白质含量为60%～80%，是世界上最大的动物蛋白资源库，南极磷虾蛋白的营养价值比牛肉和对虾还要高，研究表明南极磷虾含有丰富的氨基酸组成，其中谷氨酸含量最高。磷虾蛋白具有良好的开发利用价值，已经被开发为功能蛋白浓缩物[6]。南极磷虾酶解液具有巨大的开发应用潜力，是一种良好的磷虾蛋白利用方式，但是南极磷虾深度酶解过程伴随着氟的释放，使得酶解液氟含量过高。人们在大量摄入时，很可能会导致氟摄入量超出安全限量，对其安全构成潜在的威胁，不利于磷虾的开发利用。为了更好地开发利用南极磷虾，有必要对酶解液进行脱氟处理，降低其氟含量[7]。

目前，关于南极磷虾肽的抗氧化功能活性研究鲜有报道，此次试验以南极磷虾为试验对象，通过单因素试验和正交试验对酶解液进行脱氟，然后对最适条件下的酶解液从多个方面评价其抗氧化功能活性，为南极磷虾的应用奠定一定的理论基础和应用基础。

1 材料与方法

1.1 材料、设备与仪器

南极磷虾粉，自制；抗坏血酸VC、邻苯三酚、三氯乙酸，美国Sigma公司；乙腈、三氟乙酸，英国Alfa Aesar公司；Ca(OH)2、乙酸、硼酸、盐酸，北京化工厂；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶，诺维信生物技术有限公司。

SY21-KP4恒温水浴箱，北京市长风仪器仪表公司；AB104-N电子天平，梅特勒托利多公司；LC-20A高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；3K-15型冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 脱氟南极磷虾肽的制备

原料南极磷虾粉→匀浆→稀盐酸调节pH至4.5→超声水洗→离心取渣→加水搅拌→NaOH调pH至7→酶解4 h→Ca(OH)2脱氟→离心取上清→冷冻干燥

单因素试验包括超声水洗时间、Ca(OH)2添加量、反应温度、反应时间。超声时间对脱氟的影响试验：超声水洗时间分别设为5，10，15，20和25 min，Ca(OH)2添加量1%（按体积计），温度40 ℃，反应时间60 min；Ca(OH)2添加量对脱氟的影响试验：超声水洗时间20 min，Ca(OH)2添加量分别设为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1%（按体积计），温度40 ℃，反应时间60 min；反应温度对脱氟的影响试验：超声水洗时间20 min，Ca(OH)2添加量0.6%，温度分别设为20，30，40，50和60 ℃，反应时间60 min；反应时间对脱氟的影响试验：超声水洗时间20 min，Ca(OH)2添加量0.6%，温度40 ℃，反应时间分别设为15，30，45，60和75 min。

在单因素试验基础上确定正交试验的因素及水平，选用L9(34)正交表进行正交试验，试验设计见表1。确定最佳的南极磷虾肽的脱氟制备工艺，南极磷虾粉经检测氟含量为227 mg/kg。

表1 正交试验设计表

1.2.2 南极磷虾肽的氨基酸和分子量分布测定

依据GB 5009.124[8]，采用L-8900日立全自动氨基酸分析仪对南极磷虾肽中的氨基酸组成进行测定；将样品用流动相溶解后并经孔径0.2 μm聚四氟乙烯过滤膜过滤，然后通过高效液相色谱仪进行凝胶过滤，根据标准曲线得到样品的分子量分布。

1.2.3 南极磷虾肽的抗氧化活性测定

南极磷虾肽的抗氧化活性从4个方面体现，其中包括DPPH·自由基清除能力测定[9]、羟自由基（·OH）清除能力测定[10]、超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力测定[11]以及还原能力测定[12]。

1.2.4 统计学处理

试验数据采用Origin 9.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析，若t检验，p＜0.05，则证明数据差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾肽脱氟的单因素试验

由图1（A）可知，随着水洗时间的延长，南极磷虾酶解液的氟含量呈先下降后升高的趋势。当超声水洗时间为5～20 min时，南极磷虾肽酶解液的氟含量依次降低，随着时间的延长，南极磷虾肽酶解液中更多的氟被溶出，使得氟含量降低；但当水洗时间为25 min时，氟含量反而升高，原因可能是超声时间延长导致酶解液中以非离子形式存在的氟更多地被溶出，因此超声水洗时间20 min比较合适，选择此时间作为后续试验条件。

由图1（B）可知，随着Ca(OH)2添加量的增加，氟含量呈下降趋势。当添加量为0.2%时，酶解液氟含量为59.28 mg/kg。当添加量为0.2%～0.6%之间时，随着添加量的增加，酶解液氟含量呈急剧下降趋势。当添加量为0.6%时，酶解液氟含量仅为42 mg/kg。当添加量超过0.6%时，酶解液氟含量降低并不明显。因此选择0.6%作为Ca(OH)2最适添加量。

由图1（C）可知，在20 ℃条件下，酶解液氟含量为65.01 mg/kg。当反应温度提高到40 ℃时，酶解液氟含量明显降低至43.09 mg/kg。随着温度的进一步提高，酶解液氟含量降低趋势不明显；当反应温度为50 ℃时反而略有上升。过高的反应温度可能会对酶解液的营养价值造成损失，故选择40 ℃作为反应的最适温度。

由图1（D）可知，反应15 min后就已有脱氟效果，此时酶解液的氟含量为44.98 mg/kg。随着反应时间的进行，脱氟效果较好，氟含量呈现降低的趋势。当反应时间为60 min时，酶解液的氟含量仅为27.91 mg/kg。当反应时间增加到75 min时，脱氟效果反而略有下降。为避免脱氟时间过长造成成本浪费，同时考虑脱氟效果，故选择60 min作为反应的最适时间。

图1 单因素试验结果

2.2 南极磷虾肽脱氟的正交试验

根据单因素试验结果，对超声水洗时间、Ca(OH)2添加量、反应温度、反应时间4个因素进行L9(34)正交试验，结果见表2。影响南极磷虾酶解液脱氟的因素主次顺序是D＞B＞A＞C，即反应时间＞Ca(OH)2添加量＞超声水洗时间＞反应温度；最佳试验方案是D2B2A2C2，即反应时间60 min、Ca(OH)2添加量0.6%、超声水洗时间20 min、反应温度40 ℃，在此条件下脱氟效果最好，酶解液氟含量仅为24.78%±0.56%，较南极磷虾粉氟含量降低89.08%。

表2 正交试验结果

2.3 南极磷虾肽的相对分子质量和氨基酸组成测定

表3表明，南极磷虾肽的相对分子质量小于1 000 U的组分高达93.233%，其中500～1 000 U的组分占21.160%，140～500 U的组分占68.263%。研究表明，小分子肽的吸收效率比氨基酸高，更容易被人体吸收利用，进而发挥其多种功能活性。据报道，肽的抗氧化活性与其相对分子质量有关，而低分子量肽与DPPH·清除活性密切相关[13-15]。总之，高含量的低分子量肽进一步增强了其抗氧化活性，为后续研究其活性奠定了基础。

表3 南极磷虾肽相对分子质量分布情况

表4 南极磷虾肽氨基酸含量 g/100 g

从表4可知，南极磷虾肽氨基酸含量丰富，富含人体所需的8种必需氨基酸和2种半必需氨基酸（组氨酸和精氨酸），含量分别为29.402%和6.073%，占氨基酸总和的47.609%，具有较高的营养价值。据报道，肽的氨基酸组成对其抗氧化活性有重要的作用，例如疏水性氨基酸（亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、芳香族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等[16-18]；南极磷虾肽含有较高含量的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸以及脯氨酸，因此南极磷虾肽是一种潜在的抗氧化活性物质。

2.4 南极磷虾肽的体外抗氧化分析

2.4.1 南极磷虾肽DPPH·清除能力

DPPH·是乙醇中稳定的含N自由基，通常用于确定抗氧化化合物的给氢或清除自由基的能力，其吸光度与受试样品的抗氧化性呈反比线性关系，因此DPPH·清除是体外研究抗氧化的一项重要指标[19-20]。由图2（A）可以看出，南极磷虾肽在质量浓度1～5 mg/mL范围内，南极磷虾肽对DPPH·的清除能力近似随质量浓度的增加呈直线上升趋势。当南极磷虾肽质量浓度＞5 mg/mL时，DPPH·清除能力增加趋势并不明显；当质量浓度为25 mg/mL时，清除率达到97.75%；南极磷虾肽清除DPPH·的IC50值为2.12 mg/mL。抗坏血酸VC是一种高效抗氧化剂，具有极强的DPPH·清除能力，其IC50值为4.5 μg/mL，虽然VC的抗氧化性能更强些，但是VC属于单一的化学成分，而南极磷虾肽属于天然的功能活性物质，服用安全性高；并且南极磷虾肽浓度较高时同样起到与VC相近的DPPH·清除作用。

2.4.2 南极磷虾肽·OH清除能力

羟自由基（·OH）是活性氧中对人体毒性最大的一种自由基，能够破坏细胞的结构和功能，造成机体损伤[21]。由图2（B）可知，南极磷虾肽质量浓度在1～9 mg/mL范围内，·OH清除率随质量浓度的增加而增加，当质量浓度达到9 mg/mL时，其·OH的清除率达到76.67%；南极磷虾肽·OH清除的IC50值为5.72 mg/mL。阳性对照VC的IC50值为0.76 mg/mL，是南极磷虾肽的7.53倍，但此次试验测定得南极磷虾肽的·OH清除能力要高于梁帅峰[22]测定的牡蛎肽（IC50=6.4 mg/mL）和赵玲等[23]测定的海参水煮液多肽（IC50=6.658 mg/mL）。

2.4.3 南极磷虾肽O2-·清除能力

超氧阴离子自由基（O2-·）具有很强的氧化性和还原性，在细胞内与羟基结合后会导致细胞DNA损伤；通常采用邻苯三酚自氧化法测定抗氧化剂清除O2-·的能力[22,24]。如图2（C）所示，南极磷虾肽的O2-·清除活性呈浓度依赖性。此外，其清除O2-·的IC50值是16.43 mg/mL。阳性对照抗坏血酸VC的IC50值是0.04 mg/mL，具有很强的清除能力，约是南极磷虾肽的410倍。此次试验测定的南极磷虾肽清除·的IC50值要低于韩道才[25]用Alcalase蛋白酶水解出的罗非鱼酶解液（IC50=12.47 mg/mL），却高于于娅等[26]用Alcalase碱性蛋白酶制备的牡蛎酶解液（IC50=23.00 mg/mL）。

图2 南极磷虾肽的抗氧化分析

2.4.4 南极磷虾肽还原能力

还原力是评价物质抗氧化能力强弱的重要指标，试验表明：南极磷虾肽的吸光度随着浓度的增加而增大，具有一定的浓度依赖性，表明南极磷虾具有较强的还原能力。南极磷虾肽可作为电子供体与自由基进行反应从而终止自由基链式反应；此外，南极磷虾的还原能力还与酶解后暴露出的氨基酸残基可能有关，它们可能含有侧链—OH 或能提供电子[24,27]。

3 结论

通过单因素试验及正交试验，确定南极磷虾酶解液脱氟的适宜条件，即超声水洗时间20 min、Ca(OH)2添加量0.6%、反应温度40 ℃、反应时间60 min。在此条件下，酶解液的氟含量仅为24.78 mg/kg。南极磷虾肽粉的分子量主要集中在1 000 U以下，尤其是140～500 U的分子量占比达68.263%；其氨基酸组成丰富；抗氧化试验表明南极磷虾肽具有较强的DPPH·、·OH、O2-·清除能力和较强的还原力，其清除DPPH·、·OH、O2-·的IC50值分别是2.12，5.72和16.43 mg/mL，说明南极磷虾肽具有较好的抗氧化能力。因此，南极磷虾肽可作为一种天然安全的抗氧化物质，应用于功能性食品、生物制药及化妆品等领域。