基于膜分离的阿拉伯低聚半乳糖的制备

施锴云 ，杨波，李琴，杨光，益莎 ，贺亮*

1. 浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江省林业科学研究院（杭州 310023）；2. 上海理工大学医疗器械与食品学院（上海 200093）

阿拉伯半乳聚糖（AG）是一类具有高度支链的中性多糖，具有多种生物活性如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等，有研究表明AG还具有调节肠道的功能[1]，在2002年时作为食品添加剂被美国FDA通过认证[2]。AG的相对分子质量约6.8×105Da，其结构主要由半乳聚糖作为主链，阿拉伯糖作为其支链与半乳糖通过β-1, 3键或β-1, 6键连接[3]，但其相对分子质量较大，只有将其分子链降解断开，才能更好发挥其生物活性。

有研究表明，相较于未降解的多糖，经过降解的多糖在抗氧化及免疫活性等方面都有显著提高。朱振元等[4]采用酶解法等3种方法降解古尼虫草菌丝体多糖，发现其抗氧化活性良好。张海芸等[5]采用超声辅助自由基法降解阿拉伯半乳聚糖，发现该多糖降解后比降解前在清除羟自由基和DPPH上有一定提高。刘露等[6]使用山药低聚糖作为碳源加入到双歧杆菌培养基中，发现可以提高双歧杆菌的生长速率。然而降解无法定向获得所需相对分子质量的低聚多糖，经试验表明，降解后的阿拉伯低聚半乳糖呈非连续性分布，跨度在1×103～5×103Da[7]。另外葡萄糖、乳糖等小分子糖类会不同程度地包含在降解物中[8]，这种分布使得分离单一分子量的多糖有较大难度，从而对多糖后续的理化研究及结构分析产生影响[9]。另一方面，传统的柱层析法分离多糖虽具有操作条件温和，可以保持分离成分理化性质的优点[10]，但是层析速度慢，精度较低，需要大量洗脱剂，对资源和环境造成浪费和污染，工业化难度较高。因此在多糖的提取和降解后，必然需要对多糖分离纯化的方法进行探索和优化。超滤（UF）和纳滤（NF）是热门的新型膜分离技术[11]，该技术利用不同孔径微孔滤膜，以膜组件两侧压力差为推动力，将不同质量的溶质进行分离、分级或浓缩[12-13]。由于整个过程中没有产生相变，节能环保，短时高效，成本低廉，在食品药品行业中具有强劲的发展趋势[14-15]。试验以阿拉伯半乳聚糖的降解液为原料，结合2种膜分离法，对阿拉伯低聚半乳糖的制备纯化工艺进行优化，利用体外试验研究阿拉伯低聚半乳糖对动物双歧杆菌生长的促进作用，为实现功能性低聚多糖生产规模化、应用集成化提供数据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

pH计（Sartorius PB-10）；台式离心机（Neofuge 15）；电子天平（BSA224S）；85-2型磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）；Biosafer SB25-12DT型超声清洗仪（南京赛飞生物科技有限公司）；紫外分光光度计（北京高能科迪科技有限公司）；MZ2CNT真空泵（德国Vacumbrand）；多角度激光散射仪DAWN HELEOS II（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；小型切向流超滤系统（Millipore公司）。

1.1.2 主要试剂

阿拉伯半乳聚糖（百龙创园科技有限公司）；无水硫酸亚铁、乙酸铜（国药试剂集团）；30%过氧化氢（杭州晶欣化工有限公司）；无水乙醇（上海穆百化工有限公司）；葡萄糖（天津巴斯夫化工有限公司）；硫酸（国药试剂集团）；苯酚（成都科龙化工试剂厂）；氢氧化钠（国药试剂集团）；硝酸钠（上海晶纯生化科技股份有限公司）；Proclin300（西格玛奥德里奇贸易有限公司）；Bio-5微孔滤膜（山东招金膜天有限责任公司）；陶氏NF270-4040纳滤膜。

1.2 试验方法

1.2.1 阿拉伯低聚半乳糖的制备

参考张海芸等[5]的方法并作出修改，用蒸馏水溶解阿拉伯半乳聚糖，使其质量浓度为10 g/L，磁力搅拌溶解30 min。加入1 mmol/L乙酸铜，调节pH 6.0。加入体积分数6% H2O2，混匀并置入提前以60 ℃预热好的超声仪器中（功率600 W）。打开超声仪并不断搅拌60 min后，加入0.6 g/100 mL NaHSO3终止降解反应。过0.45 μm微孔滤膜滤去杂质，即得阿拉伯低聚半乳糖，将其命名为Oligo-AG。

1.2.2 膜分离工艺流程

采用切向流超滤系统（TFF）（见图1）。操作流程为样品溶液经调速泵流入膜分离组件，以切向流通过膜组件，压力差为驱动力，从膜分离柱外腔透过口流出的为透过液，从回流口流回样品槽的为截留液。

图1 膜分离工艺流程

1.2.3 超滤运行参数优化

为确定超滤膜运行的最佳参数，在25 ℃条件下，探究以Oligo-AG为进料液时，不同稀释倍数对超滤膜截留性能的影响；稀释倍数1∶5时，不同操作压力对超滤膜截留性能的影响；稀释倍数为1∶5时，操作压力0.2 MPa时，不同料液温度对超滤膜截留性能的影响。

1.2.4 多糖含量的测定

分别各5 mL截留液和透过液，加入20 mL无水乙醇，于4 ℃醇沉12 h，以5 000 r/min离心15 min后，弃上清，将沉淀用蒸馏水复溶，并用100 mL容量瓶定容，采用苯酚-硫酸法[16]测定多糖含量。以未超滤的多糖降解液为对照组。

1.2.5 降解液中阿拉伯低聚半乳糖的分子量分布测定

参考王一寓等[17]的方法并做出一定修改，采用高效凝胶过滤色谱-多角度激光散射法（HPSEC-MALLS）对多糖的纯度、重均分子量等指标进行检测分析。

1.2.5.1 样品溶液配制

配置含有0.02% Proclin 300的超纯水、过2层0.22 μm微孔滤膜的超纯水；将5 mg/mL样品溶解到已经配制好的超纯水中；用磁力搅拌器以适宜的温度和转速不断搅拌助溶12 h后，过0.22 μm滤膜。

1.2.5.2 样品检测条件

用含有0.02% Proclin300的超纯水进行配制0.1 mol/L硝酸钠溶液作为流动相，过0.22 μm滤膜。

打开检测软件（ASTRA version 5.3.4），设置折光率增量dn/dc为0.138 0 mL/g，运行时间60 min，采用100 μL样品环上样，流速0.5 mL/min，将TSK gelG 5000PWXL（30 cm×730 cm×7.8 mm ID×10 μm）和TSK gel G 3000PWXL（30 cm×7.8 mm ID×6 μm）进行串联，并在串联柱安装前连接上保护柱 TSK PWXLGuard Column（7.5 cm×7.5 mm ID），柱温25 ℃，待激光信号稳定后即可进样。

1.2.6 评价指标

超滤膜衰减通量（σ）、溶质透过因子（P）、表观截留率（R）和超滤膜多糖回收率（Wr）计算如式（1）～（4）。

式中：ft和f0分别是过滤时间在t和0时刻的渗透液通量，L/（m2·h）；CP和C0分别是原液和透过液中Oligo-AG浓度，g/L；CP2和VP2分别是超滤时的料液质量浓度和料液体积，g/L，L。

1.2.7 阿拉伯低聚半乳糖对双歧杆菌生长速率的影响

1.2.7.1 双歧杆菌活化

双歧杆菌活化采用改良MRS培养基，121 ℃高压灭菌15 min后备用。

在无菌无氧操作条件下，取双歧杆菌菌种，接种于双歧杆菌基础培养基上，37 ℃厌氧培养48 h后，取5%的接种量在改良MRS中传代3次，以10 000 r/min离心15 min后收集沉淀，重悬于无菌生理盐水中后，将活性菌转移到含有不同碳源的培养基中。

1.2.7.2 阿拉伯低聚半乳糖对双歧杆菌活化生长曲线的影响

在无菌无氧的情况下执行以下操作：进行在酶标板上加入150 μL双歧杆菌培养基，在培养基中分别加入阿拉伯半乳聚糖和降解后的阿拉伯低聚半乳糖，以10 μL硅油液封。置入荧光细胞分析仪中，静置培养20 h，采用双波长法，每隔2 h测量1次600和800 nm处吸收波长，以葡萄糖为对照组，研究阿拉伯低聚半乳糖对双歧杆菌体外生长曲线的影响。

1.3 数据处理方法

所有试验做3个平行，取平均值，处理数据采用Origin Pro 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 降解液中Oligo-AG相对分子质量分布

超滤膜包的选择应根据超滤组分相对分子质量大小来确定，因此对降解后的阿拉伯半乳聚糖相对分子质量分布采用HPSEC-MALLS法进行测定，其分布情况如图2所示。由图2可见，Oligo-AG相对分子质量较小，分布不集中，其跨度约500～5 000 Da，因此采用5 kDa的超滤膜组件对Oligo-AG进行膜分离。

对该组件的多糖截留和透过效果进行考察，截留液中Oligo-AG质量浓度为3.18 g/L，透过液中Oligo-AG质量浓度为7.59 g/L，损失率为3.41%，占总Oligo-AG的71.53%。结果表明，采用5 kDa超滤膜组件具有较好的分离纯化效果，同时符合文献报道的该部分组分活性较好的规律[18-19]。因此先采用5 kDa膜组件分离出相对分子质量小于5 kDa的组分，再采用纳滤膜组件对500 Da以下的葡萄糖、寡糖等小分子物质进行分离。

2.2 料液比对膜通量的影响

不同稀释度的Oligo-AG降解液对5 kDa膜组件膜渗透通量的影响如图3所示。从图3可以看出，鉴于对降解液进行稀释有助于提高膜通量，因而随着降解液浓度的降低，料液黏度降低，降解液在膜组件中的流动性变小，进而降低了渗透阻力和浓差极化[19]。虽然不断降低Oligo-AG的浓度可使膜通量继续增加，但同时Oligo-AG分离效率和多糖得率也会降低。因此，初步选择稀释浓度60%。

图2 降解液中Oligo-AG的相对分子质量分布

图3 降解液浓度对膜通量的影响

2.3 操作压力对膜通量的影响

操作压力是超滤系统的主要作用力，对膜分离效果的作用至关重要。稀释倍数1∶5时，不同操作压力对超滤分离Oligo-AG的膜渗透通量的影响如图4所示。同一压力条件下，Oligo-AG料液的膜渗透通量随着超滤时间的延长而逐渐降低。这是因为在超滤初始阶段，膜表面形成凝胶层，而随着时间增长，料液逐渐阻塞腹孔，超滤膜渗透阻力升高，导致膜通量降低。相同时间下，随着操作压力升高，Oligo-AG的渗透通量逐渐升高。这主要是由于增大压力即增大了膜分离的推动力，然而压力过高会使得溶质的透过速率比溶剂小，这会导致透过液多糖浓度降低，截留率升高，使得Oligo-AG的总回收率降低。因而综合考虑系统操作压力要求和多糖损失率，压力不宜过高，初步选取的操作压力为0.2 MPa。

2.4 料液温度对膜通量的影响

稀释倍数1∶5，操作压力0.2 MPa时，料液温度对超滤分离Oligo-AG膜渗透通量的影响如图5所示。同一时间下，膜通量随着料液温度的升高而增大。这是因为随着料液温度升高，多糖降解液的黏度降低，有利于降解液中的Oligo-AG在溶液中扩散，提高了降解液在膜组件中的流动性，可以减少超滤膜表面污染物的吸附，进而使得渗透阻力与浓差极化均不断降低。然而料液温度的升高的同时还需要考虑膜能耗和膜性能，以及保证该温度范围内的多糖性质不变。由于料液温度超过20 ℃时，超滤膜的浓差极化时间推迟，膜通量变化不再明显，且考虑到膜的耐受性，试验选取的温度范围为20 ℃。

图4 操作压力对膜通量的影响

图5 料液温度对膜通量的影响

2.5 正交试验优化

为使单位时间内超滤膜多糖透过量最大，并且膜通量也较高，使得膜分离效率最大化。采用L9(33)正交试验设计对3个主要参数，即降解液浓度、操作压力、料液温度进一步优化。试验因素和水平表见表1。

所得结果采用极差分析和方差分析，正交试验设计结果见表2。

极差分析可以通过各水平平均值极大值与极小值的差来表示出各因素对膜通量和多糖透过量的影响大小，极差值越大，对试验结果的影响越大。由表2可知，膜通量极差值最大的因素为稀释倍数，其R=6.83，即稀释倍数对膜通量影响最大，多糖透过量极差值最大的因素为操作压力，其R=29.29，即操作压力对多糖透过量影响最大。膜通量平均值最大的组合为A1B2C3，多糖透过量平均值最大的组合为A2B3C3，因此可以确定料液温度为20 ℃时，分离效率最高。对各因素进行方差分析，结果见表3。

根据方差分析（表3）结果可知，3个因素中稀释倍数和操作压力对膜通量和多糖透过量均具有显著性影响（p＜0.05），料液温度对膜通量和多糖透过量的影响均不显著（p＞0.05），其中对膜通量的影响最显著的是稀释倍数，而对多糖透过量的影响最显著的是操作压力，这与正交试验结果相吻合。虽然操作压力的升高对膜通量的升高具有正向作用，但对多糖透过量却具有反向作用，因此，结合以上分析，能够获得最佳分离效率的膜分离条件应取稀释倍数1∶5，操作压力0.2 MPa，料液温度20 ℃为最佳操作参数，这与多糖的膜分离规律相符[21]。

表1 L9(33)正交试验因素和水平表

表2 正交试验设计及试验结果

表3 正交试验方差分析结果

2.6 膜分离后的Oligo-AG的相对分子质量分布

对经过超滤膜组件及纳滤膜组件分离纯化后得到的Oligo-AG相对分子质量分布进行检测，结果如图6所示。经过膜分离的多糖，其主要成分为4 500 Da的Oligo-AG，纯度约91.2%。在正交试验中获得的最佳条件下，膜分离结果表明膜通量和多糖的透过量而分别为25.3 L/（m2·h）和130.32 g·m2/h，多糖损失率较低，仅2.34%。

图6 分离纯化后的Oligo-AG的相对分子质量分布

2.7 膜分离后的Oligo-AG对双歧杆菌生长曲线的影响

经过膜分离的Oligo-AG和AG对动物双歧杆菌生长速率的影响如图7所示。前2 h双歧杆菌在不同碳源的培养基中生长速度缓慢，处于迟缓期，培养2 h后，双歧杆菌进入对数期，这期间活菌数和增值速率急剧增加，然而由于营养物质有限，8 h左右进入稳定期，并产生如乙酸、乳酸、丙酸等代谢物[22]。在同一时间内，AG作为碳源的培养基中双歧杆菌活菌数对数值比对照组高11.20%，而相对于AG，Oligo-AG所在的培养基内双歧杆菌活菌数的对数值比AG高14.34%，比葡萄糖高28.89%，可以明显促进双歧杆菌繁殖。前2 h双歧杆菌处于稳定期，培养基的pH 2～8 h内迅速降低，双歧杆菌活菌数与pH呈负相关，说明双歧杆菌可利用葡萄糖、AG和Oligo-AG产生酸代谢物。由图7可见，相对葡萄糖和AG而言，Oligo-AG作为碳源时，培养基的pH更低，即双歧杆菌对Oligo-AG的利用率更高。以上结果表明，Oligo-AG更适合作为双歧杆菌的碳源，能够提高双歧杆菌的生长速率及活菌数。

图7 膜分离纯化后的Oligo-AG对双歧杆菌生长曲线的影响

3 结论

采用超声辅助自由基的方法降解阿拉伯半乳聚糖，并选用5 kDa超滤膜和纳滤膜对其进行分离纯化。研究降解液浓度、操作压力、料液温度分别对Bio-5超滤膜分离效果的影响，通过正交试验设计优化3个操作参数，结果得出超滤条件为稀释倍数1∶5、操作压力0.2 MPa、料液温度20 ℃时，具有最佳的分离效果。在此条件下，膜通量和多糖透过量分别达到25.3 L/（m2·h）和130.32 g·m2/h，所得Oligo-AG组分的纯度为91.2%，透过率占降解液总多糖的31.24%，损失率为3.11%。且相较于未降解的阿拉伯半乳聚糖，经过降解和膜分离纯化的Oligo-AG对动物双歧杆菌的生长数量具有明显的促进作用。与传统分离纯化方法相比，膜分离法可以更加快速高效的完成低聚多糖的分离纯化，有利于更好地实现低聚多糖的功能性研究。