超声波-过氧化氢优化甘草酸提取工艺

高少雄，于波，郑晓宇

中国石油大学（北京）理学院（北京 102249）

甘草是中国传统中草药中需要量最庞大的药材之一。中医认为甘草具有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛 、缓和药性等功效[1]，是卫生部批准的药食同源食物之一[2]。甘草在中国资源丰富、种植广泛，在西北、东北、华北地区均有分布[3]。因此甘草的开发具有重要经济价值。甘草酸是甘草中的主要活性成分，是一种三萜皂苷类物质，除具有止咳、保肝、抗病毒等药用作用[4]外，也是甘草甜味的主要来源，是迄今为止发现的最好的天然甜味剂[5]。而甘草酸的各盐类也广泛应用于医疗、食品、饮料[6]、化妆品等领域，尤其是其铵盐具有调节免疫[7]、抗氧化、消除氧自由基、稳定膜等作用[8]，拓宽甘草酸的应用前景。正因如此，甘草酸提取过程中，增加其提取率有着重要意义。

常用的甘草提取方法主要包括传统的浸渍法、升华法、水蒸气蒸馏法[9]、热回流法、索氏提取法等[10]，其提取的本质是甘草酸由甘草细胞内部溶解到固液界面再向溶剂主体扩散的传质过程[11]。因此改善传质过程中的动力与阻力可有效增加提取率，如超声强化提取机理就是利用超声波的冲流、湍流、机械振动、细胞破壁、空化等作用加速甘草酸向溶剂中的扩散，来促进整个提取过程[12]。甘草细胞壁是甘草酸提取过程中主要的传质阻力，若能降解构成细胞壁的主要物质木质素[13]，从而使细胞壁被破坏，便能达到降低传质阻力，提高提取率目的。木质素在生物界主要由酶降解，有研究表明可通过稀酸或超声波过氧化氢降解木质素[14-15]。

试验在超声提取基础上，以过氧化氢和乙酸形成过氧酸体系模拟木质素过氧化酶降解木质素，降低传质阻力，通过正交与效应面试验确定最佳优化条件，提高提取率，为工业生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药材

甘草采摘于新疆克拉玛依，60 ℃干燥至恒质量，粉碎机粉碎后，过孔径0.425 mm筛之后备用。

1.1.2 仪器与试剂

JYS-M01研磨粉碎机（九阳股份有限公司）；数控标准检验筛分机（新乡市倍力特振动机械有限公司）；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；智能数控超声波发生器（杭州成功超声电源技术有限公司）；PHSJ-4A型实验室pH计（上海精密科学仪器有限公司）；DTS-7型自动平衡离心机（北京时代北利离心机有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）。

甘草酸分析对照品（上海麦克林生化科技有限公司，纯度大于98%）；无水乙醇、冰乙酸、30%过氧化氢（均为分析纯）。

1.2 试验方法

1.2.1 甘草酸提取

称取3 g甘草粉末，加入60 mL一定质量分数的过氧化氢水溶液，逐滴滴加50%乙酸溶液，调节pH 4.5～5.0之间，进行超声提取，提取液离心，收集上清液，将沉淀物烘干，以60%乙醇为提取剂，80 ℃，120 W进行二次超声提取2 h，过滤二次提取液。分别测量2次提取液的吸光度，计算总收率。

1.2.2 甘草酸含量测定

称取0.020 g甘草酸标准品，使用70%乙醇定容于25 mL容量瓶，得到0.08 mg/mL甘草酸标准溶液，再分别精密移取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL标准溶液，同样以70%乙醇定溶于25 mL容量瓶中，得到质量浓度0.032，0.048，0.064，0.080和0.096 mg/mL的甘草酸标准溶液，记为1～5号样品。使用70%乙醇为空白溶液，使用紫外分光光度计在200～400 nm处扫描，分别测量1～5号样品的吸光度。对不同浓度标准溶液在最大吸收波长处的吸光度做二元回归得到甘草酸浓度与吸光度的标准曲线。再以对照品溶液及供试品溶液进行精密度及重复性测试。

2 结果与分析

2.1 甘草酸含量测定

2.1.1 甘草酸标准曲线

如1.2.2的方法在200～400 nm区间内测量1～5号甘草酸标准溶液的吸光度曲线如图1所示。

图1 甘草酸标准溶液紫外吸收曲线

受朗伯比尔定律影响，甘草酸最大吸收波长在240 nm左右，以最大吸光度为纵坐标，甘草酸质量浓度为横坐标，使用二元回归法绘制标准曲线，如图2所示。

图2 甘草酸标准曲线

对标准曲线进行线性回归处理，得到标准曲线方程（1）。

2.1.2 精密度试验

移取1.2.2中配制的0.08 mg/mL甘草酸标准溶液3.5 mL于50 mL容量瓶中，使用70%乙醇定容后，摇匀，测量其240 nm附近的最大吸光度，分别测定6次。6次测定结果相对标准偏差为0.63%，说明具有良好精密性。

2.1.3 重复性试验

取1.1.1中的供试甘草粉末5 g，80 ℃下70%乙醇提取2 h。移取所得的提取液3.5 mL于25 mL容量瓶中，70%乙醇定容后测量240 nm附近最大吸光度，分别测定6次，6次测量结果相对标准偏差1.21%，具有良好重复性。

2.1.4 提取率计算

移取0.5 mL提取液于25 mL容量瓶中，使用70%乙醇定容，测定其240 nm左右的最大吸光度，按照回归方程（1）计算甘草酸质量浓度C。甘草酸提取率计算按式（2）计算。

式中：n为提取液稀释倍数；C为由回归方程（1）所得甘草酸质量浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；m为所用供试药材的质量，mg。

2.2 空白试验

称取3 g甘草粉末，加入60 mL的60%乙醇溶液，80 ℃，120 W下超声提取2 h，抽滤后测量提取液吸光度，计算提取率，重复3次，平均提取率为13.61%。

2.3 单因素试验

2.3.1 过氧化氢含量的影响

分别配制质量分数3%，6%，9%，12%和15%的过氧化氢溶液按照1.2.1方法进行初次提取，固定提取温度60 ℃，提取功率120 W，提取时间2 h。结果如图3所示，甘草酸提取率随过氧化氢含量增加先上升后下降，在9%处最大为18.09%。过氧酸体系形成后，降解木质素，细胞壁被破坏，传质阻力降低，从而使提取率增大，但随着过氧化氢含量进一步增大，其强氧化性会破坏甘草酸结构，导致提取率降低。

图3 过氧化氢含量对甘草酸提取效果的影响

2.3.2 超声波提取时间的影响

按照1.2.1初次提取方法，固定提取温度60 ℃，提取功率120 W，使用6%过氧化氢溶液分别提取1，2，3，4和5 h。结果如图4所示，在2 h处有最大提取率16.68%。继续提取，虽然过氧酸体系可以更充分地降解木质素，但由于外部提取液的甘草酸含量逐渐大于细胞内部，形成浓度差，反而增加传质阻力，减小提取率。

图4 超声波提取时间对甘草酸提取效果的影响

2.3.3 超声波提取温度的影响

分别在40，50，60，70和80 ℃下按照1.2.1进行初次提取，功率120 W，提取时间2 h，过氧化氢含量6%，结果如图5所示，提取率随温度升高而提高，在70 ℃达到峰值18.36%，超过70 ℃后则急剧减小。可见随着温度升高过氧酸体系降解木质素作用加强，传质阻力降低，且甘草酸溶解度随温度升高而升高，使得初次提取率增加，进而提高总收率，但随着温度进一步升高，甘草酸结构被破坏，收率随之大幅下降。

图5 超声波提取温度对甘草酸提取效果的影响

2.3.4 超声波功率的影响

按照1.2.1的提取方法，固定温度70 ℃，时间2 h，使用6%过氧化氢溶液，分别在90，105，120，135和150 W下进行初次提取。提取率先升高后减小，在120 W处有最大收率18.36%。最开始，超声波功率较弱，过氧酸体系不能够打开各种化学键降解木质素，但随着功率的增加，过氧酸体系的作用越来越强，但超过120 W时，由于原料的量较少，超声波不完全作用于原料上，从而造成“空超”现象，甚至破坏甘草酸结构，导致收率下降。

2.4 正交试验

对影响甘草酸提取的4个因素超声温度（A）、超声功率（B）、过氧化氢含量（C）、超声时间（D）进行优化，采取L9(34)正交设计进行试验，考察因素水平见表1，正交试验结果见表2。4个影响因素对提取率影响的主次为：功率（B）＞温度（A）＞过氧化氢含量（C）＞提取时间（D）。其中，提取时间（D）在所选因素水平上影响较小，可对另3种因素进行进一步考察。正交试验给出的最佳提取条件为A2B2C2D1，即70 ℃、120 W下，使用9%的过氧化氢溶液进行初次提取2 h。离心分离后，收集上清液，并将沉淀物烘干后，在80 ℃、120 W下使用60%乙醇进行二次超声提取2 h，抽滤后收集滤液，2次提取的甘草酸之和即为总收率。

图6 超声波功率对甘草酸提取效果的影响

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

2.5 效应面试验

2.5.1 试验结果

在正交试验的基础上，使用Box-Behnken效应面法原理进行试验设计，选取超声温度、超声功率、过氧化氢含量3个自变量，甘草酸提取率为效应值设计三因素三水平效应面分析试验，其中包括12个析因点和5个中心点，共计17个试验点。试验方案及结果见表3和表4。方差分析表见表5。

表3 效应面法分析因子及水平

表4 Box-Behnken试验设计方案及结果

表5 方差分析表

2.5.2 模型建立与显著性分析

使用Design Expert 10.0对表4中的数据进行效应面分析，得到二元回归方程（3）。

且从表5中可知模型的p＜0.000 1（＜0.01），具有较好显著性，而失拟项的p=0.556 1（p＞0.5）不显著，同时该模型R2=0.978 8，即97.88%的效应值变化来源于所选因素。数据说明，模型的拟合度良好，该模型可用于表示各自变量与效应值之间的多元关系。

各影响因素中，一次项中提取功率（B）具有统计学意义（p＜0.01），同时各因素交互作用不显著，而二次项中B2、C2（功率与功率的交互作用、温度与温度的交互作用）具有统计学意义。从F值可知对甘草酸提取率影响大小顺序为提取功率＞提取温度＞过氧化氢含量，与正交试验所得结果相同。

2.5.3 效应面交互作用分析

以过氧化氢含量、超声功率、超声温度中的两者为X和Y轴，以甘草酸提取率为Z轴，使用Design Expert 10.0作出对应的三维图，通过效应曲面和等高线可较为直观的反映各因素的交互作用。曲面越陡峭，则该因素影响越大。由图7～图9可知，响应曲面均是开口朝下的凸面，等高线近似圆形，中心处于考察区域内，说明在考察区域内存在最大效应值，其中图8，即超声温度与过氧化氢浓度的效应曲面相对平缓，说明其交互作用相对较弱。

图8 超声温度和过氧化氢浓度对甘草酸提取效果影响的效应曲面

图9 超声温度和超声波功率对甘草酸提取效果影响的效应曲面

2.5.4 最佳提取条件确定与验证

由Design Expert 10.0得出最佳提取条件为：过氧化氢含量8.65%、超声功率124.45 W、提取温度68.83℃。修正为过氧化氢含量8.7%、超声功率124 W、提取温度68 ℃。以此条件通过1.2.1中方法进行提取，平行3次试验，所得提取率平均值为18.91%，与理论提取率相差2.9%，可见，该二元方程所建立效应面模型预测可行。

3 结论

试验结果表明，超声提取过程中，加入过氧化氢与乙酸形成过氧酸体系可以有效地降解木质素，从而破坏细胞壁，降低甘草酸提取过程中的传质阻力，提高提取率。正交试验与效应面试验结果表明，过氧化氢含量8.7%，超声功率124 W，提取温度68 ℃时，提取时间2 h，经二次提取后可以最大程度提高提取率，达到18.91%，相比于一般的超声提取，可增加提取率3.3%。

虽然工艺尚未进行放大试验，且存在成本较高等问题，但研究表明，方法可有效提升甘草酸收率，为后续该工艺的工业化奠定理论基础。