β-防御素生理特性的研究进展

赵国春，扣泽华，孔令聪,2，刘立英

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林省新兽药研发与创制重点实验室，吉林 长春 130118；3.辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009）

防御素是抗菌肽中的一个大家族，具有高效、广谱的不同于抗生素的独特抗菌机制。根据二硫键位置的不同其可分为三个不同亚家族：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。其中β-防御素通常含有3对分子内二硫键，大多是由38～42个氨基酸残基组成的阳离子双亲分子，相对分子质量为2～6ku。β-防御素除了在呼吸道、肠道和骨髓上皮组织中有表达外，在结膜和胎盘等其他组织中也发挥着宿主防御作用。此外，相关报道已证实，β-防御素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、念球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和假丝酵母等具有较好的抗菌活性，同时在抗病毒和先天免疫方面表现出强大的活性。总之，β-防御素的抗菌、抗病毒性能对于科研和生产具有重要意义，已成为影响生物机体健康状态的重要抗菌肽之一。

1 β-防御素的化学结构

防御素亚家族成员是带有阳离子且富含半胱氨酸的抗微生物肽，具有独特的六个半胱氨酸残基的特征性片状结构，依靠分子内部的三个二硫键维持结构稳定，六个半胱氨酸残基之间的键合及其键合模式为C1-C5，C2-C4，C3-C6。该类肽由三条反向平行链组成，它们以一种“反式”排列与二硫键相连。尽管发现二硫键对其抗菌活性并不重要，但除去二硫键会导致非结构化肽水解，稳定性降低。天然防御素具有半衰期短且不稳定的特点，经过化学修饰后能弥补其不足，而且在高温条件下其性质仍能保持稳定且生物活性不受影响[1-2]。β-防御素的典型特征是能够折叠成各种二级结构，包括α-螺旋、β-结构、转角、延伸结构和其他排列[3]。

2 β-防御素的合成和释放

β-防御素在上皮细胞中合成。大多数β-防御素基因具有两个外显子，一个外显子编码富含疏水性亮氨酸信号序列的前原肽，另一个外显子编码成熟肽。当哺乳动物防御素双外显子基因转录成相应的mRNA时，外显子1形成5'UTR区和具有编码信号肽的mRNA区，初级翻译产物在N-端具有非活性前体肽和信号序列。外显子2形成3'UTR和编码成熟肽的mRNA区，而成熟肽是由前体片段切割形成的，它们在N末端具有信号序列，在C末端具有短前体片段[4]。

通常情况下，微生物信号、发育信号、细胞因子和某些神经内分泌信号以组织特异性的方式调节防御素的合成和释放[5]。β-防御素最早从牛上皮细胞和中性粒细胞中分离得到，随后在各种脊椎动物身上都有发现。骨髓是产生成年动物中性粒细胞的主要组织，骨髓β-防御素mRNA合成的总体特征类似于中性粒细胞α-防御素的基因转录模式[6]。β-防御素储存在与吞噬泡融合的中性粒细胞致密颗粒中。在牛中性粒细胞致密颗粒中有三种典型的中性粒细胞β-防御素：BNBD-4，BNBD-12和 BNBD-13，这三种中性粒细胞β-防御素的mRNAs在骨髓中含量最为丰富，在骨髓生成早期完成BNBD-4的合成，而BNBD-12仅存在于新的致密颗粒中，与组织蛋白酶前体一同分泌[7]。β-防御素前体半衰期非常短，初级翻译产物迅速转化为成熟的β-防御素。中性粒细胞在骨髓中成熟并聚集颗粒库，停止颗粒合成后富含防御素的初级颗粒与吞噬泡发生融合，在吞噬泡中产生高浓度的防御素[8]。当其被释放到血液外周循环时β-防御素已经完成合成。

3 β-防御素的抗微生物特性

防御素作为先天免疫反应的成员，参与体内各种抗菌反应，保护机体免受细菌、真菌的侵害。试验证明，大多数防御素在一定条件下具有广谱抗菌活性，尤其对细菌和真菌具有较强的抗菌活性，在抗病毒方面也显示出独特的优势。

3.1 β-防御素的抗细菌作用

Chen等人为了解各种抗菌素之间是否存在协同作用而进行了研究，他们发现，hBD-1、2、3（human βdefensins），ll-37（组织蛋白酶 ll-37）和溶菌酶之间的不同组合对处在中性环境中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有协同或叠加抗菌作用。在酸性环境中，hBDs、ll-37和溶菌酶与金黄色葡萄球菌的协同作用得到增强。相比之下，在酸性环境中上述抗菌剂对大肠杆菌的抗菌活性主要体现为叠加而非协同作用[9]。Midorikawa K等人[10]也开展了相似研究，发现hBD-2、3和Cap18在角质形成细胞中同样具有协同作用，只是β-防御素与Cap18的协同作用表明，这两种肽对金黄色葡萄球菌的作用方式，其表达模式存在差异。然而与防御素具有广谱杀菌活性相悖的是，Wang等人[11]在研究人β-防御素对乳酸菌的抗菌作用时发现，hBD-1、2、3对实验室三种乳酸菌菌株没有明显的杀灭作用。由此可以得出，hBDs能够作为人体的安全抗菌剂，且不会干扰肠道共生菌平衡。在对特应性皮炎（AD）的研究中，发现AD是一种与金黄色葡萄球菌有关的慢性炎症性皮肤病，此为预防金黄色葡萄球菌介导的AD提供了潜在的治疗途径[12]。但另一份研究表明，AD发病与hBD-1缺陷有关。AD损伤组织HBD-1中5′区的CpG3和CpG4位点的甲基化，导致启动子活性降低，并影响hBD-1的转录调控，且甲基化特征将成为治疗因hBD-1缺陷引起的角质层受损的有效靶点[13]。有研究团队利用毕赤酵母和枯草杆菌的密码子分别构建表达纯化重组猪防御素2（rpBD-2），pBD2/CP1[防御素 2（pBD-2）和抗菌肽 cecropin P1（CP1）]融合肽，结果表明，其表达产物均能对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌产生抗菌活性。在猪饲料中添加重组枯草杆菌，能显著促进仔猪生长，降低仔猪腹泻发生率。通过重组细菌表达的抗菌肽有望成为一种新型抗菌药物[14-15]。也有团队利用Tol-2转座子系统构建转基因鸡系过表达禽防御素-3（AvbD3），以减少家禽产品上的细菌生长，提高鸡的先天免疫能力[16]。

3.2 β-防御素的抗真菌作用

β-防御素除了对体内外细菌具有抗菌活性外，对真菌同样具有抗菌活性。目前对于β-防御素抗真菌活性的研究主要集中在念珠菌。念珠菌是一种条件致病菌，寄生在人体黏膜上，当宿主免疫力下降时会导致其过度生长。Tomalka等人[17]研究发现，小鼠β-防御素-1（mBD-1）对黏膜念珠菌感染的控制非常重要，并且在先天性炎症介质诱导中起着关键作用，mBD-1能通过增强白细胞浸润和炎症基因调控来调节宿主免疫力。此外，hBD-1、2、3已被证实对念珠菌具有杀菌活性[18-19]。有研究发现，由hBD-3羧基端15个氨基酸所组成的合成肽（HBD3-C15）可通过增加细胞膜通透性清除白色念珠菌。该合成肽还能作为治疗复发性根尖周炎的根管内药物[20-21]。

3.3 β-防御素的抗病毒作用

防御素抗病毒活性的机制较复杂，其随特定肽、细胞、病毒类型的不同而不同；且防御素在体内发挥抗病毒活性时常常是多种类型相互协同。最新的试验发现，hBD-3对VV有很强的抗病毒活性。然而AD患者皮肤中的hBD-3生成不足，hBD-3缺乏会增加AD患者对系统性VV感染的敏感性[22-23]。HIV病毒作为一种攻击人体免疫系统的病毒，它主要攻击人体淋巴细胞，造成机体免疫功能丧失。对于HIV病毒的防治一直是一个棘手的问题。Quiñones-Mateu等[24]研究了β-防御素对HIV病毒的抗病毒活性。在正常人口腔上皮细胞中，HIV-1可诱导hBD-2、3的mRNA表达（重组hBD-1无抗病毒活性），其表达分别比常规表达高4～78倍，能通过与病毒直接发生作用以及调节CXCR4受体来阻断HIV-1复制。有人在研究hBD-2在体内外促进抗病毒免疫的能力时发现，与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）棘突蛋白（S-RBD）受体结合的hBD-2能提高抗病毒和原代免疫诱导分子的表达水平，促进白细胞趋化因子表达增加，增强SRBD特异性中和抗体应答，此为hBD-2能够作为一种有效的抗病毒疫苗佐剂提供了理论依据[25]。Crack等人对hBD-2的研究发现，外源hBD-2可抑制水痘带状疱疹病毒（VZV）的胞内复制，在体内的特异性抗体能阻断其抗病毒作用[26]，而hBD-2衍生物会不会出现不一样的情况，这需要进一探究。总之，β-防御素在抗病毒方面存在巨大潜力，其后续研究有望带来新的突破。

4 总结与展望

β-防御素作为一种重要的阳离子肽，是生物免疫系统中的重要调节因子，同时对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、病毒以及真菌都具有一定的活性。根据抗菌肽（包括β-防御素）的杀菌活性机制差异，已经提出数种抗菌模型，包括桶壁模型、地毯模型、环孔模型等，但目前针对β-防御素杀菌机制似乎只基于地毯模型，这难以解释β-防御素在杀菌上的广谱性，且对其肽分子在膜孔中的具体排列方式尚不清楚。已经发现数种革兰氏阳性和阴性菌的活性能被β-防御素在不同程度上抑制，但β-防御素针对真菌的杀菌活性似乎仅限于念球菌，尚未发现针对于其他真菌的报道。此外，β-防御素针对各类病毒诸如HSV、HIV、HPV和各类癌症如前列腺癌、肾癌等均有不同程度的抗病毒作用和免疫作用，有望成为诊断和治疗疾病的标志物。总之，抗菌肽一直是科学家的研究热点，但针对β-防御素的研究才刚刚起步，尚有许多未知领域需要进一步探索。

表1 β-防御素对细菌、真菌和肿瘤细胞的作用机理