小尾寒羊生长激素（GH）基因的多态性分析

范征宇 ，胡琦杭 ，黄高想 ，邵俊红 ，时坤鹏 ，张佳庆 ，胡陆星 ，白俊艳 ＊，赵淑娟 ，郑 立 ，毛世豪 ，王 亮，张溢满，任旭鸽，郭泊瑶

（1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳471023；2.河南省汝州市动物卫生监督所，河南 汝州 467500；3.河南牧业经济学院，河南 郑州450000）

生长激素（GH）是由动物脑垂体前叶嗜酸性细胞合成和分泌的一种单链蛋白质类激素，由186～191个氨基酸组成的一种具有广泛生理功能的生长调节素。GH具有广泛的生理作用，作用机理复杂，影响着动物机体蛋白质、脂肪和糖的代谢[1-2]，与其生长发育、繁殖等密切相关。 Valinsky等[3]（1990）利用 PCR-RFLP技术分析了绵羊GH基因，证明扩增片段存在两个等位基因。Marques等[4]（2001）分析了5个绵羊品种的GH基因外显子，发现除外显子1外，其余均存在多态位点。于洪川等[5]（2002）利用PCR-RFLPs技术对滩羊普通品系和体大品系的研究发现，滩羊GH基因存在PvuⅡ酶切位点多态性，有A与B两种基因和AA、BB、AB三种基因型。 张红平等[6]（2008）对南江黄羊GH基因(gGH)部分片段进行了PCR-RFLP分析，并对GH基因的PCR-RFLP与早期生长发育性状的相关性进行了研究。哈志俊等[7]（2010）的研究结果表明，GH基因在欧拉型藏羊的5'端侧翼序列存在2个等位基因，3种基因型；χ2检验表明，该群体在这一位点上处于 Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05)，多态信息含量为0.1522，属于低度多态（PIC＜0.25）。本研究采用PCR-SSCP技术与测序相结合，对小尾寒羊的GH基因进行多态性分析，为小尾寒羊分子标记辅助育种的开展和生产性能、生产效益和经济效益的提高提供基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物来自偃师县农户的40只小尾寒羊，采用颈部静脉采血方法采样，ACD抗凝处理，在冰壶中低温运回实验室，血样于-20℃保存，用于基因组DNA的提取。

1.2 试验方法

引物设计：采用周汉林等[8]发表的引物序列，扩增产物大小为198 bp，扩增区域为682～879，引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下：

Forward：5′-TCTAGGACACATCTCTGGGG-3′，

Reverse：5′-CTCTCCCTAGGGCCCCGGAC-3′。

PCR 扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s；56 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s，35个循环；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

利用硝酸银染色法染色，最后拍照，利用Popgen软件统计基因型频率、基因频率及多态信息含量等相关指标。

2 结果与分析

2.1 小尾寒羊GH基因PCR产物电泳检测结果

小尾寒羊GH基因PCR产物琼脂糖电泳结果见图1。可以看出，GH基因的目的片段大小约198 bp，是目的条带。对小尾寒羊GH基因的PCR产物进行SSCP分析，结果见图2，结果表现出3种基因型，分别命名为AA基因型、BB基因型和AB基因型。AA、BB基因型有3条带，其中最后一条带比较靠下的是AA型，另一种为BB型，AB基因型则有4条带。

2.2 小尾寒羊GH基因的多态指标

从表1中可以看出，在小尾寒羊中存在3种基因型分别为AA、BB和AB，这3种基因型频率分别为0.2813、0.1875 和 0.5312，AB 基因型频率最高。 A、B等位基因频率分别为0.5469和0.4531。群体杂合度为0.5312，有效等位基因数为2.1331，PIC值为0.3728，呈中度多态。

表1 GH外显子的基因频率及多态性指标

2.3 小尾寒羊GH基因的测序分析

GH外显子2的AA基因型与BB基因型的序列比较结果见图4，经过比较发现，GH外显子2的第101位点和145位点处2种基因型有不同的突变。在第101位点和第145位点上，AA基因型为G和R（AG套峰），BB基因型为S（GC套峰）和A。

3 讨论

管松等[9]（2009）检测了海南黑山羊GH基因第5外显子的SNP多态性，结果经SSCP分析出现了3种基因型，分别定义为CC、CG和GG；3种基因型频率分别为：0.213、0.732 和 0.055。 周汉林等[8]（2009）分析海南黑山羊GH基因第2外显子exon2的多态性，SSCP结果出现3种基因型，分别定义AA、AB、BB；3种基因型频率分别为0.283、0.63、0.087。顾亚玲等[10]（2010）对绵羊的生长激素(GH)基因进行检测，结果共检测到2种GH基因型，即AB和BB型，基因型频率分别为0.3481和0.6519，AB基因型对绵羊生长性状的影响更为显著 (P＜0.01)。本试验选取小尾寒羊GH基因外显子2进行分析，结果经SSCP分析出现了3种基因型，分别定义为AA、AB、BB；3种基因型频率分别为 0.2813、0.5312和 0.1875，A、B 等位基因频率分别为0.5469和0.4531，以A等位基因为优势基因，本研究结果与管松、周汉林以及顾亚玲的试验结果存在差异，这表明不同绵羊群体、不同基因位点的多态性是不同的。