非洲猪瘟荧光定量PCR检测常见问题分析及注意事项

冯妹玲

（廊坊市广阳区动物疫病防控中心河北廊坊 065000）

非洲猪瘟荧光定量PCR 检测实验，不论是对仪器设备还是技术人员技术操作水平，均是要求较高的实验。在实验操作过程中稍有疏忽即可造成实验失败。笔者根据近两年实验室实际操作非洲猪瘟定量荧光PCR 检测实验过程中遇到的问题及注意事项总结如下，仅供参考。

1 影响此实验结果的因素

1.1 非检测因素

1）标本：样本的采集部位、样品的质量以及样本的保存方法、保存时间等对实验结果都有一定的影响；

2）建筑条件（实验室结构）：实验室空间结构布局是否合理、是否严格分区、是否有通风设备等；

3）管理水平：实验室是否按照规章制度执行、实验操作是否严格按照操作规范在生物安全柜内完成加样等与实验结果是否准确都是密不可分的。

1.2 检测因素

1）人的因素：实验员的工作态度、技术水平以及在实际操作过程中的操作习惯等均可造成不同的检测结果；

2）仪器的因素：仪器设备的稳定性、均匀度、光敏感感应管、加热退火的模块和时间、激发灯管的强度、数据分析的难易程度均可影响实验的结果。例如：温度模块：包含最基本的升降温，要保证温度模块的均一性，既不能有边缘效应，也不能有局部温度的影响。光学模块：荧光PCR 反应的过程中每一个循环都要测一次光，测光不论是照相还是扫描，不同仪器都有一定的差别，光学模块的敏感性要高。软件模块：荧光信号采集以后，要用软件模块来进行分析，分析不但要人性化，还要准确，不能有故障。个人认为此实验对仪器设备的精密度要求较高。

2 阳性对照无扩增曲线

1）在实验过程中如果阳性对照无扩增，首先应确定是阳性对照的问题还是体系的问；

2）反应成分存在漏加现象：加样过程中样品加到管壁上；或者是吸取样品时，吸取量不够；加样时应将吸头尖伸至液面以下，这样不会出现反应液漏加或少加；

3）确定反应条件是否合适；应严格按照试剂说明书操作，在规定的条件下进行反应；

4）试剂保存问题；检查试剂是否按照说明书条件保存使用，如果保存试剂温度过高，会使酶的活性下降，从而造成实验室失败；

5）仪器是否正常工作或设置：检查仪器设置是否正确。

3 无扩增曲线或Ct 值出现过晚：Ct>38

3.1 阳性对照

首先确认阳性对照反应是否正常，如果阳性对照正常，应从以下几方面考虑：

1）病毒含量较低：目的基因低于10～100 个拷贝，或采样部位病毒含量低；

2）模板降解：样本保存不当；

3）反应体系中存在PCR 反应抑制剂，如：高盐、乙醇、苯酚、SDS 和甲酰胺；可能使目标样本的浓度太低，通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引物二聚体使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。出现这种情况必须重新采样、重新提取核酸或加大模板稀释倍数重复实验。

切记：不同试剂盒的阳性对照，或下发的阳性标准物质非本试剂盒靶基因片段，阳性物质不通用。

3.2 试剂盒的保存问题

温度过高将会导致产品活性下降，应在-20℃以下保存可以长期保持活性。反复冻融导致产品活性下降，每次用量较小时，推荐小体积分装后-20℃保存。

3.3 程序设置不当

未设置信号采集步骤及荧光信号种类，循环数未正常设置。设置固定的程序模板。

3.4 仪器及耗材问题

仪器加热模块问题，不能正常扩增；滤光片发霉，PCR 管盖或管底被标记遮挡，不能采集荧光或者是使用错误的PCR 反应管透光性不够；应定期对仪器进行校准，此实验中对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。

4 重复性差

4.1 重复性差的原因主要表现

同一个样品一次为阴性，一次为阳性；有的样品重复后，结果相差较大；同一个样品不同的孔之间数据相差较大；不同的人操作结果不一样。

4.2 措施

1）加样体积失准：使用性能较好的移液枪，由于荧光PCR 实验中加样的体积都特别小，所以对移液器的精确度要求较高，如果移液器吸取的量不准确就会造成扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中，造成实验结果失准；

2）液体加到管壁上：由于加样的量特别少，在加样过程中稍不留神就有可能加到管壁上，应快速离心，使液体混匀充分反应；

3）定量PCR 仪不同位置温度不一致：定期校准仪器；

4）定量PCR 仪不同位置温度升降不一致：定期校准仪器；

5）模板浓度太低：模板浓度越稀，重复性越差，取不同组织进行试验；

6）q PCR mix 没有完全混匀：使用前充分溶解并混匀。

5 可疑的扩增：假阳性

5.1 阴性对照也出现明显扩增和Ct 值

1）反应体系组分被污染：PCR 反应液污染，会出现检测的所有样本为阳性则需要更换新的反应液；如果阴性对照污染，仅阴性对照为阳性需要更换新阴性对照或者水重复实验；

2）交叉污染：防止交叉污染的措施，应将反应体系在生物安全柜内配制并加样，最后加入阳性对照，阳性对照使用前进行离心，防止管壁粘连的液体污染移液器，使用带滤芯的枪头；

3）取不同组织进行试验；

4）q PCR mix 没有完全混匀：使用前请充分溶解并混匀。

5.2 实验室污染

1）对实验室进行严格的区域划分，减少气溶胶污染；

2）隔离污染来源，待污染解除后更换试剂重新试验；

3）用DNA 祛除剂喷洒。

建议：拿到试剂盒后，将PCR 反应液按18μL分装至PCR 反应管中，-20℃保存，每次使用取相应的管数进行试验。可防止反应液的污染和反复冻融引起的试剂降解。

6 参考染料

1）参考染料能够很好地避免因仪器和用户所造成的错误，对于采用参考染料的仪器，其软件将惰性染料的荧光信号从靶序列发出的荧光中删除；

2）ROXTM的强度过高，可导致目标信号返回效果极差，扩增曲线呈锯齿状且不连续；

3）关闭ROXTM通道并重新分析标准品和数据，则数据恢复正常。

7 扩增曲线不光滑

1）扩增曲线弯曲、杂乱：可能是由于模板核酸质量较差，含有高盐、苯酚和乙醇残余物质。应该去除有问题的反应孔并重新分析标准曲线，重新纯化模板，去除模板中存在的潜在抑制物；

2）扩增曲线突然骤降：可能使反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。应在进行扩增反应之前仔细检查反应管内是否有气泡残留，最好是在离心机上离心一下再进行扩增反应；

3）扩增曲线断裂或下滑：可能是基线设置不当，基线的终点值大于Ct 值。应重新设置基线值，减小基线终点，重新分析数据；

4）扩增曲线呈锯齿状且不连续：Rox 添加不当，需去掉参比荧光或校正参比染料。

笔者在此实验操作过程中仅发现以上问题，仅供在一线实验室工作的小伙伴们参考。切记，做非洲猪瘟定量荧光PCR 检测实验时一定要做到：要严格按照实验室质量规程管理，严防气溶胶的产生；要严格规范实验操作，严防样本之间的交叉污染；要特别注意移液器和吸头引起的交叉污染，必须使用带滤芯吸头；要经常使用DNA 祛除剂。相信工作在实验室一线的小伙伴们都能够严格按照操作规程完成此实验，愿我们一起为畜牧业发展而努力。