分子生物学技术在家畜血吸虫病诊断上的应用

李跻

（宁夏永宁县闽宁镇农业服务中心银川 750104）

关键字：PCR 技术；诊断；家畜血吸虫病；应用与推广

以间接血凝试验（IHA）为代表的血清学诊断技术逐步在我国家畜血吸虫病诊断中发挥越来越重要的作用，但其始终作为一种初筛的工具，不能作为确诊的依据。以粪便毛蚴孵化为代表的病原学诊断技术是家畜血吸虫病确诊的“金标准”，但随着流行程度和感染强度的进一步降低，其敏感性饱受诟病。检测核酸物质的方法为家畜血吸虫病诊断开辟了新途径，在特定意义上，核酸检测也属于病原学检测的范畴，可作为家畜血吸虫病确诊的依据。另外，多项研究证实，核酸检测具有较高的敏感性和特异性。核酸检测一般基于PCR 技术建立，2002 年，粪便PCR 诊断技术首先应用于检测曼氏血吸虫感染，其后，PCR 诊断技术应用不断增多，并相继出现诊断日本血吸虫和埃及血吸虫病的报道[1]。下面就将基于PCR 及其延伸技术在家畜血吸虫病诊断上的应用介绍如下：

1 血吸虫核酸检测的可行性

只要病原体存在于家畜或受体体内，机体内就会有其核酸物质的存在，日本血吸虫生活史和寄生部位的特殊性决定了核酸检测技术的可行性。日本血吸虫尾蚴侵入家畜皮肤后转变为童虫，此后血吸虫就在家畜的循环系统中移行、发育、成熟和产卵。在上述的过程中，血吸虫的体被和表膜发生更新、脱落，包括细胞在宿主血液中发生崩解，其核酸物质就持续出现在宿主血液中，有关日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢研究显示，核酸在进入小鼠体内后，首先分布在血清中，随后随血液进入肝脏[2]。PCR 可将微量的靶DNA 特异性地扩增，从而提高了对DNA 分子的分析和检测的可能性，也相应的提高了检测的敏感性。目前，从常规PCR 到巢式PCR、实时定量PCR、LAMP 等技术均有在家畜血吸虫病诊断的报道。

2 现有的核酸分子靶标

诊断靶标的选择是目前分子生物学诊断技术核心问题，从本质而言对样本核酸的检测即为对靶标分子的检测。下为主要研究的靶标基因或分子。

2.1 核糖体18S rRNA 基因序列

18S rRNA 基因序列长度为1883bp，为血吸虫看家基因，拷贝数较多，以其为靶标序列先后在日本血吸虫不同发育阶段的动物宿主的多种样本中检测到了特异性片段。基于该基因建立起了常规PCR、荧光定量PCR 技术，检测限可达10fg，并且在感染的早期即可检测到该靶标，提示18S rRNA 靶序列的诊断价值。

2.2 逆转录转座子SjR2

SjR2 具有高度保守和多拷贝的特点，长3,921bp，在基因组中约有400 个完整拷贝和23,755 个不完全拷贝，分散在整个染色体中，并可在血吸虫生活史多个阶段及动物宿主粪便和血清中检测到。基于此靶基因建立起常规PCR、荧光定量PCR 及LAMP 法，其敏感性可达到80fg/μL 和0.08fg/μL，并且可在感染早期扩增出特异性条带，并于治疗后一段时间转阴，除具有诊断价值外还具备疗效考核价值。

2.3 线粒体基因

线粒体基因为基因一片段的总称，因线粒体在日本血吸虫病进化史上较为保守，基因变异程度较小，有可能具有特异性诊断日本血吸虫病的价值，尤其用于区别其他物种。目前，常用的线粒体基因有COX1、NADH1 等，以其作为靶标建立的相应PCR 技术检测限也可达到pg 级别。由于线粒体基因相对保守，其在鉴别诊断与日本血吸虫亲缘关系较近的虫种时可能存在一定的交叉反应，导致诊断的特异性降低。

2.4 5D 基因

编码日本血吸虫毛蚴抗原的5D 基因是最早应用于日本血吸虫核酸诊断的靶基因。该基因为日本血吸虫基因组中一重复序列，大小为560bp，以其为目的基因建立的的检测技术除具备良好的敏感性外，其特异性较高也是该基因的一大优势。

3 核酸分子检测技术

PCR 技术是分子生物学技术中发展最快，普及最为迅速，应用最为广泛的技术之一，目前在经济较为发达的地区，县级动物疫病控制部门几乎都配有PCR 仪。PCR 技术是体外酶促合成特异DNA 的方法，使少量甚至痕量目的基因在体外快速扩增达到检测级的方法。目前，除用于家畜血吸虫病诊断外，其已经在越来越多的动物疫病的诊断、检测中发挥着重要作用，并且在标准PCR 的基础上，衍生出多种PCR 方法。除常规PCR 外，常见的还有巢式PCR、荧光定量PCR 和环介导等温核酸扩增（LAMP）[3]。这些方法的发展使动物血吸虫病的诊断向高敏感、高精度的方向发展。尤其LAMP 技术，其摆脱了PCR技术对于仪器依赖，可用肉眼直接进行结果的观察。

4 核酸样品制备及处理方法

在家畜血吸虫病分子生物学诊断中最常用的样本为血样和粪样。粪样DNA 作为模板的PCR 检测方法最早可在感染后3 周出现阳性反应，血样则可在感染1～2 周后就可有阳性反应，提示分子生物学诊断技术可具有早期诊断的价值。传统提取粪样DNA 使用ROSE 法，血样采取碱裂解法，目的为除去DNA 中的PCR 反应抑制物。现今由于商品化的试剂盒的发展，DNA 提取更加快捷方便，加速了分子生物学技术在基层的应用。

5 讨论

高特异性和敏感性是核酸分子技术得到迅速发展的重要因素，其中特异性是评价一种检测技术的最重要的指标之一。血吸虫具有许多特异的基因序列，检测其特异性基因片段与检获虫体具有同样的诊断价值。分子生物学技术直接针对血吸虫的DNA 片段，理论上具有高度的特异性，比血清学方法更加可靠、稳定。此外，分子生物学检测具有早期诊断价值，可在感染的较早期采取相应的措施包括药物治疗，即可减少料肉转化的经济损失，又可避免大型家畜产生含虫卵的粪便持续维持血吸虫生活史，造成连续的传播。PCR 产物的生成量是以指数方式增加，能将微量甚至痕量级的待测产物扩增到微克的可检测级别，这种扩大方式为该类方法的敏感性提供了基础，但同样又面临的敏感性过高带来的假阳性问题。此外污染也是核酸检测产生假阳性的重要原因，在实际的操作中，多数的假阳性的出现源于污染原因。目前，虽然基层很多疫控和畜牧兽医部门具备PCR 检测的仪器设备，处理大量的现场样本及随后的上机检测需要消耗较长时间，分子生物学试剂费用相对较高等缺点给分子生物学方法在基层的推广带来一定的难度，但分子生物学检测方法是未来发展方向，尤其是家畜血吸虫病流行程度较低后对精准检测具有更多的需求。

6 小结

近年来，除在小鼠和兔血吸虫感染分子生物学检测外，牛羊血吸虫病的PCR 检测的报道逐渐增多，因此早日开发出稳定、高效的适用于牛羊等动物的血吸虫病核酸分子检测方法必将提高动物血吸虫病的诊断水平，从而为动物血吸虫病的防治和流行病学提供新的方法。