网膜素-1调节JAK-2/STAT3防止关节软骨破坏

李志刚 张耀 田丰德

【摘 要】 基质金属蛋白酶（MMP）在细胞外基质的降解和骨关节炎（OA）的病理进展中起关键作用。网膜素-1是新近确定的抗炎脂肪因子，以前鲜有关于网膜素-1在OA中的保护作用的报道。在本研究中，我们的结果表明网膜素-1在人软骨细胞的mRNA和蛋白水平上均抑制了促炎细胞因子白介素1β（IL-1β）诱导的MMP-1，MMP-3和MMP-13的表达。重要的是，网膜素-1的给药以剂量依赖性方式消除了IL-1β诱导的II型胶原蛋白（Col II）和聚集蛋白聚糖（關节软骨中两个主要的细胞外基质成分）的降解。从机理上讲，是因为网膜素-1通过阻断JAK-2 / STAT3通路改善了干扰素调节因子1（IRF-1）的表达。我们的结果表明网膜素-1具有防止关节软骨破坏的能力。

【关键词】 骨关节炎;网膜素-1;基质金属蛋白酶;Ⅱ型胶原

【中图分类号】R684.3

【文献标志码】B

【文章编号】1005-0019（2020）22-196-01

1 前言

包括关节软骨退化在内的器质性改变是骨关节炎（OA）的关键标志。在OA中，软骨损伤是由于软骨细胞的分解代谢能力和合成代谢能力之间的平衡失调引起的[1]。这可能导致胶原蛋白和蛋白聚糖的分解速率超过新基质分子的合成速率，从而导致软骨降解。导致OA软骨破裂的另一个因素是由关节软骨细胞产生的炎性细胞因子的增加，例如白介素1β（IL-1β）。IL-1β是炎性关节中滑膜细胞、软骨细胞和侵入性巨噬细胞释放的促炎细胞因子[2]。已有文献证明，IL-1β在OA软骨中显着增加。最近大量研究表明，IL-1β在OA的发病机制中起着至关重要的作用。IL-1β的高表达与分解代谢因子的合成有关，例如基质金属蛋白酶（MMPs）[3]。已有学者在OA软骨和滑膜组织中发现了MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达增加。值得注意的是，MMP-1、MMP-3和MMP-13的高表达会导致Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）和软骨聚集蛋白聚糖的过度降解[4]。当前，没有能够延迟OA进展的治疗或药物。然而，干扰MMPs的表达及其随后的ColⅡ和聚集蛋白聚糖的降解已经成为治疗OA的重要靶标。

脂肪因子是从脂肪组织中释放出来的一系列激素，据报道它们可调节多种生物进程，例如能量稳态、炎症和骨代谢。网膜素-1是一种在内脏脂肪中发现的新型34 kD脂肪因子，在血浆和细胞外液中大量存在。先前的研究表明，网膜素-1具有抗炎作用，并且可以调节生物体中的免疫反应[5]。网膜素-1通过抑制p38和JNK的失活并抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达而发挥抗炎作用，并抑制血管平滑肌细胞中超氧化物的产生。另外，网膜素-1抑制了TNF-α介导的血管内皮细胞中促炎性分子（如COX-2和eNOS）的诱导作用。这些结果表明网膜素-1可能在OA中发挥保护作用。我们目前的工作集中于网膜素-1调节人软骨细胞中细胞外基质降解中作用的研究。

2 材料和方法

2.1 人软骨细胞的细胞培养

软骨样品来自人股骨颈骨折进行髋关节置换的患者。将软骨组织切成小块，在浓度为0.15%的胰蛋白酶溶液中消化2 h，然后在37 mg的3mg/ml I型胶原酶中孵育，温度为37°C。离心后，将细胞悬浮在含有10%FCS，2 mM L-谷氨酰胺和1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM/Hams 12（Dulbeccos Modified Eagles Medium/Hams F-12）培养基中。以2×104个细胞/cm2的密度接种细胞，每3-4天更换一次培养基。将融合的原代软骨细胞用人重组网膜素-1分别以100、200、300 ng/ml的浓度处理24小时，然后再用IL-1β（10 ng/mL）刺激24小时。

2.2 分离总RNA和实时PCR

从原代培养的软骨细胞中提取细胞内RNA。使用2μgRNA和Omniscript试剂盒进行逆转录。使用Go Taq QPCR预混液在LC480 LightCycler real-time PCR系统上进行了real-time PCR实验。GAPDH用作内标，使用ΔΔCt方法计算基因表达。

2.3 蛋白质印迹分析

在行指定的处理后，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液裂解细胞样品。使用二辛可宁酸（BCA）方法测定蛋白质浓度。用8%～12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的提取蛋白（10μg），并通过电印迹转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上2 h。将印迹在5%脱脂奶粉中于室温封闭1小时，然后在4°C抗孵育过夜。然后将膜用含0.05%Tween-20的TBS（TBS-T缓冲液）洗涤3次，然后与过氧化物酶结合的二抗在37°C下孵育1小时。最后，用增强的化学发光（ECL）试剂盒（显影印迹。

2.4 免疫荧光显微镜

使用免疫荧光显微镜分析人软骨细胞中IRF-1蛋白的表达水平。用DPBS洗涤3次后，将细胞在室温下用4%甲醛固定10分钟，然后在室温下用2.5%BSA封闭1小时。然后，将细胞与抗IRF1抗体（1：500）在含有2.5%BSA和0.1% Tween-20的PBS中于4°C孵育过夜。接下来，将样品用PBS洗涤3次，然后用Alexa进行探测 Fluor 488偶联二抗（1：1000）在室温下放置1小时。然后将细胞用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）复染，并使用荧光显微镜进行分析。

2.5 统计分析

所有实验数据至少重复3次。结果以平均值±SD表示，并通过GraphPad Prism版本5.0软件使用T检验或方差分析（ANOVA）进行了分析。P <0.05的差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 网膜素-1抑制MMP-1，MMP-3和MMP-13的表达

IL-1β诱导的软骨基质降解是由MMPs、软骨聚集蛋白聚糖酶和其他分解代谢酶介导的。MMP-1，MMP-3和MMP-13裂解ColⅡ将直接或间接的影响细胞外基质[16]。因此，我们分别通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹分析评估了网膜素-1对MMP-1，MMP-3，MMP-13基因表达和蛋白质表达的影响。我们的结果表明，IL-1β处理可显着提高MMP-1，MMP-3和MMP-13的mRNA水平和蛋白表达，而网膜素-1处理可抑制这种表达。

3.2 Omentin-1改善人原代软骨细胞中ColⅡ和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的降解

Aggrecan和ColⅡ是OA病理过程中MMP降解的两种最重要的蛋白质类型。因此，我们通过蛋白质印迹分析研究了网膜素-1在蛋白水平上对Aggrecan和ColⅡ表达的影响。用不同浓度（100、200、300ng / ml）的网膜素-1预处理人原代软骨细胞24小时，然后再用IL-1β（10 ng / mL）刺激24小时。结果表明，IL-1β显着降低了Aggrecan和ColⅡ蛋白的表达水平，这通过用网膜素-1以浓度依赖性的方式来防止。

3.3 Omentin-1抑制IRF-1表达

干扰素调节因子1（IRF-1）是重要的转录因子，与IL-1β诱导的炎症反应相关，并参与MMPs的表达。此外，IRF-1在OA的生理过程中也起着重要作用[17]。我们通过real-time PCR和免疫荧光染色分别在mRNA水平和蛋白质水平上检测了IRF-1的表达。结果表明，网膜素-1在IL-1β诱导的mRNA和蛋白水平上均显着降低IRF-1的水平。

3.4 omentin-1对JAK2 / STAT3途径激活的影响

JAK2/STAT3通路已被证明参与调节OA中的IRF-1和MMP表达。我们的研究表明，IL-1β治疗可显着提高软骨细胞中STAT3的酪氨酸磷酸化水平。通过以剂量依赖的方式施用网膜素-1可以改善STAT3的激活。此外，JAK2抑制剂AG490成功阻断了IL-1β诱导的STAT3磷酸化，从而抑制了IL-1β对IRF-1的诱导，表明JAK2和STAT3参与了这一作用。

4 讨论

网膜素-1是一种必需的新型脂肪因子，主要在内脏脂肪组织中产生。网膜素-1以其慢性抗炎能力而闻名。网膜素-1抑制肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导的环氧合酶（COX）-2表达。据报道，脂肪因子在软骨细胞和滑膜细胞中均有表达。另外，在OA的病理生理过程中，脂肪因子表达的改变与炎症反应和分解/合成代谢的作用有关[7]。但是，关于网膜素-1的软骨保护作用的信息鲜有報道。因此，本研究首次探讨了网膜素-1抑制IL-1β诱导的MMPs表达以及随后软骨中Aggrecan和ColⅡ降解的浓度依赖性。

MMPs在维持ECM的代谢平衡中起着至关重要的作用[8]。然而，已证明MMP的上调与OA的进展有关。IL-1β处理诱导了分解代谢基因的表达，包括MMP-1，MMP-3，MMP-9和MMP-13 [9]。值得注意的是，在低水平炎症条件下，MMP-1，MMP-3和MMP-13在软骨细胞中的ColⅡ和Aggrecan的降解中起关键作用。因此，MMP-1，MMP-3和MMP-13被认为是软骨降解的关键调节剂，并已成为关节炎治疗的有效靶标。在这项研究中，我们发现网膜素-1可以抑制这三种蛋白水解酶，在OA治疗中具有重要作用。MMP基因表达的上调受JAK / STAT通路的激活控制。MMP-1和MMP-3的诱导是通过JAK /STAT3途径介导的[10]。此外，白介素6（IL-6）及其可溶性受体（sIL-6R）通过聚集蛋白聚糖降解酶ADAMTS-4，ADAMTS-5 / 11和MMP-3和胶原降解酶的诱导诱导软骨降解。MMP-1和MMP-13由STAT1/3激活介导因此可见，促炎性细胞因子（如IL-1β）激活JAK2 / STAT3在OA的慢性炎症驱动中起关键作用[11]。

当前的研究表明网膜素-1抑制了JAK-2/STAT3通路的激活，表明网膜素-1在炎症中具有新的抑制作用。综上所述，我们的发现首次表明网膜素-1阻止了IL-1β诱导的人软骨细胞中Aggrecan和ColⅡ的降解。网膜素-1通过抑制JAK-2/STAT3途径改善了MMP的表达。这些结果表明网膜素-1可能是潜在的软骨保护性治疗剂。

参考文献

[1] M.B. Goldring， S.R. Goldring Osteoarthritis[J].J Cell Physiol，213（2007）626–634.

[2] Bradley Axelrod，Robert Heilbronner，Jeffrey Barth，Glenn Larrabee，David Faust，Neil Pliskin，Jerid Fisher，Cheryl Silver. Official Position Statement of the National Academy of Neuropsychology[J]. Archives of Clinical Neuropsychology，2000，15（5）.

[3] Rose K Davidson，Jasmine G Waters，Lara Kevorkian，Clare Darrah，Adele Cooper，Simon T Donell，Ian M Clark. Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in synovium and cartilage[J]. Rose K Davidson;Jasmine G Waters;Lara Kevorkian;Clare Darrah;Adele Cooper;Simon T Donell;Ian M Clark，2006，8（4）.

[4] Tan Bee K，Adya Raghu，Farhatullah Syed，Chen Jing，Lehnert Hendrik，Randeva Harpal S. Metformin treatment may increase omentin-1 levels in women with polycystic ovary syndrome.[J]. Diabetes，2010，59（12）.

[5] Bee K. Tan，Raghu Adya，Harpal S. Randeva. Omentin： A Novel Link Between Inflammation， Diabesity， and Cardiovascular Disease[J]. Trends in Cardiovascular Medicine，2010，20（5）.

[6] Peng-fei Hu，Jia-peng Bao，Li-dong Wu. The emerging role of adipokines in osteoarthritis： a narrative review[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（2）.

[7] Peng-fei Hu，Jia-peng Bao，Li-dong Wu. The emerging role of adipokines in osteoarthritis： a narrative review[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（2）.

[8] Tung Jayne T，Arnold Carolyn E，Alexander Lee H，Yuzbasiyan-Gurkan Vilma，Venta Patrick J，Richardson Dean W，Caron John P. Evaluation of the influence of prostaglandin E2 on recombinant equine interleukin-1beta-stimulated matrix metalloproteinases 1， 3， and 13 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 expression in equine chondrocyte cultures.[J]. American journal of veterinary research，2002，63（7）.

[9] Behera Aruna K，Thorpe Cheleste M，Kidder J Michael，Smith Wendy，Hildebrand Ethan，Hu Linden T. Borrelia burgdorferi-induced expression of matrix metalloproteinases from human chondrocytes requires mitogen-activated protein kinase and Janus kinase/signal transducer and activator of transcription signaling pathways.[J]. Infection and immunity，2004，72（5）.

[10] Saara Aittomki，Marko Pesu. Therapeutic Targeting of the JAK / STAT Pathway[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology，2014，114（1）.