匹立尼酸对肝癌TAE 术后癌旁肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体-α、 核因子-κB 和基质金属蛋白酶-9 表达的影响

范馨予，杜 伟，李正亮，吴春华，杨培鈺，熊文翠

由于过量饮酒、病毒性肝炎和食品安全问题等多种因素共同作用，我国原发性肝癌发生率较高。肝癌早期基本无临床症状，临床发现时多为中晚期，我国每年约有 40 万患者死于肝癌［1］。 经导管动脉栓塞术（transarterial embolization，TAE）具有损伤小、全身不良反应少和术后争取传统手术切除病灶可能性等优点，已在临床上推广应用于肝癌治疗［2］。但其主要通过切断肿瘤血供抑制肿瘤生长，故不可避免会对癌旁肝组织生理功能造成不同程度损伤，甚至导致肝脏机能损害［3］，如何减轻TAE 术后肝功能损伤便成为急需研究的问题。本中心前期研究发现肝癌TAE 术后癌旁肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）-α 表达下降，核因子（nuclear factor，NF）-κB表达升高，提示癌旁肝组织功能损伤的原因可能与缺血缺氧导致的氧化应激反应和炎性因子过度激活导致的氧化损伤和炎性损伤有关［4-5］。 匹立尼酸（pirinixic acid，WY14643）是一种人工合成的新型PPAR-α 激动剂，PPAR-α 激活又可与配体结合，活化转录因子，调控下游基因表达。Zhang 等［6］研究表明PPAR-α 可抑制 NF-κB 启动子，限制 NF-κB 抑制蛋白（IκB）表达，降低 NF-κB p50、p65 和 Bcl 2 水平，通过直接靶向IκB 和NF-κB 信号通路抑制细胞增殖、诱导癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。 Tsai 等［7］研究表明NF-κB 信号通路下游肿瘤进展相关蛋白基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9与肝癌病灶生长、血管生成和转移密切相关，NF-κB信号通路抑制可显著降低其表达。本研究拟通过观察给药后VX2 肝癌模型兔肝脏癌旁组织中PPAR-α、NF-κB 和MMP-9 mRNA 表达判断匹立尼酸疗效和作用机制，以期为优化肝癌TAE 治疗提供新思路和依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

100 只健康新西兰大白兔（昆明楚商科技公司，许可证号SCXK-滇K2018-001），体质量2.5～3.5 kg，雌雄各半。 2 只VX2 荷瘤兔（东南大学附属中大医院惠赠）用于传代。

1.2 实验分组和处理方法

通过传代和瘤粒注射方式构建肝癌兔模型［4-5］，共成功建立65 只经典VX2 肝癌兔模型。 根据随机数字表法，从65 只模型兔中选出60 只，随机分为对照组、TAE 组、联合治疗组，每组20 只。 对照组：不做任何处理；TAE 组：只行TAE 术；联合治疗组：TAE 术前3 d 连续耳缘静脉注射匹立尼酸（美国Sigma 公司）（3 mg·kg-1·d-1），随后行 TAE 术。

1.3 TAE 术

模型兔麻醉后固定于改良操作台上，备皮、消毒右腹股沟附近10 cm 区域；于股动脉处切开皮肤，18 G 穿刺针穿刺股动脉，送入3 F 微导管，通过导丝选至腹腔干，再超选至肝总动脉，造影明确肿瘤供血动脉位置；行超选择性肝左动脉造影，由3 F微导管推入碘化油［剂量=肿瘤直径（cm）×0.2 mL］，直至肿瘤内血流缓慢停滞；术毕拔管、结扎股动脉近端并缝合切口。确认模型兔术后苏醒并存活3 d，将其处死取肝组织，经液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。

1.4 模型兔肝功能检测

术前3 d 及模型兔处死前分别抽取外周血，分离血清，分装进Eppendorf 管（EP）做好标记，部分用于检测丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平，部分存于-20℃备用。 检测器械为BS-600 型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子公司）、ALT 和AST 试剂盒（上海博耀生物科技公司），通过化学比色法得出ALT、AST 活力值。

1.5 RNA 提取和实时荧光定量聚合酶链反应分析

取各组模型兔癌旁适量组织（与癌组织距离＞2 cm 肝组织），0.9%氯化钠溶液漂洗并做好标记，严格按照动物总RNA 快速提取试剂盒（上海捷瑞生物工程公司，货号GK3016）操作说明，通过TRIzol 法提取总 RNA，测定其光密度（OD）值；根据OD 值在1.8～2.0 对mRNA 浓度进行统一调整后，按照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（美国 Thermo 公司，货号 K1622）和 FastStart Universal SYBR Master 试剂盒（瑞士 Roche 公司，货号04913 850001）的要求进行逆转录和扩增。 引物序列见表1。 逆转录反应条件：42℃孵育50 min，85℃孵育5 min，反应结束后短暂离心，置于冰上冷却备用。 扩增条件：①95℃、10 min；②95℃、15 s，60℃、20s，72℃、25 s，40 个循环；③72℃、10 min。采用相对定量法（2-ΔΔCT法），通过 CFX96 型实时荧光定量聚合酶链反应分析仪（美国Bio-Rad Laboratories 公司）分析结果。

1.6 免疫组化检测

癌旁组织固定后用石蜡包埋并切片，脱蜡、水化，加入柠檬酸钠缓冲液修复抗原，用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，5%羊血清封闭非特异性位点15 min，滴加一抗4℃孵育过夜；磷酸缓冲液（PBS）冲洗，加入二抗37℃孵育30 min；PBS 冲洗，二氨基联苯胺（DAB）反应染色，显微镜下观察显色清况，流水冲洗结束显色；苏木素复染5 min，流水冲洗，自来水浸洗5 min 返蓝，脱水至透明；中性树胶封片，拍照存档。

表1 引物序列

由2 名病理医师独立评估结果，取平均值。 每张切片于400 倍镜下选取，观察10 个视野，依据细胞阳性表达比例和蛋白表达部位阳性信号强度进行综合评分。 细胞阳性表达比例计分：阳性细胞比例＜5%为 0 分，5%～25%为 1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%为3 分；阳性信号强度计分：细胞无染色为0 分，淡黄色为1 分，黄棕色为2 分，深棕色为3 分。 将细胞阳性评分和阳性信号强度评分之和，作为判定结果的标准：＜2 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为阳性（++），6～7 分为强阳性（+++），见图 1、2。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析。 计量资料以均数±标准差（）表示，通过方差齐性检验后行单因素方差分析，并两两比较；计数资料以百分率（%）表示，行 χ2检验，以 α=0.05 为检验水准。

2 结果

2.1 模型兔术前术后肝功能检测

三组模型兔间术前外周血ALT、AST 水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；术后联合治疗组ALT、AST 水平高于对照组，低于TAE 组，差异均有显著统计学意义（P＜0.001），见表 2。

图1 PPAR-α 免疫组化信号强度评估图

图2 NF-κB 和MMP-9 免疫组化信号强度评估图

表2 模型兔术前术后肝功能检测比较

2.2 癌旁组织中各基因mRNA 表达

PPAR-α mRNA 在联合治疗组癌旁组织表达水平（1.83±0.35）显著高于对照组（1.08±0.12）、TAE 组（1.13±0.07），差异均有统计学意义（图 3①）；NF-κB mRNA 在联合治疗组癌旁组织表达水平（1.48±0.28）显著低于 TAE 组（1.79±0.10），差异有统计学意义，但与对照组（1.34±0.33）比较，差异无统计学意义（图3②）；MMP-9 mRNA 在联合治疗组癌旁组织表达水平（1.21±0.36）显著低于 TAE 组（2.85±0.44），差异有统计学意义，但与对照组（1.07±0.24）比较，差异无统计学意义（图3③）。

2.3 癌旁组织病理学改变和蛋白免疫组化阳性率

图3 癌旁组织中各基因mRNA 表达

40 倍光镜下苏木精-伊红染色切片显示，对照组肝细胞大小一致，排列整齐，围绕肝小叶中央静脉呈放射状分布，肝细胞肝索结构完整；TAE 组肝小叶结构破坏，肝细胞弥漫大片坏死、崩解，并伴有大量中性粒细胞浸润；联合治疗组肝小叶结构部分破坏，部分肝细胞坏死、崩解，并伴少量中性粒细胞浸润，见图4。

PPAR-α 在联合治疗组癌旁组织中阳性率（70%）显著高于对照组（30%，χ2=6.400，P=0.011）、TAE 组（20%，校正 χ2=8.182，P=0.004），差异均有统计学意义；NF-κB 在联合治疗组癌旁组织中阳性率（30%）显著低于 TAE 组（65%，χ2=4.912，P=0.027），差异有统计学意义，但与对照组（20%，校正χ2=0.133，P=0.715）差异无统计学意义；MMP-9 在联合治疗组癌旁组织中阳性率（35%）显著低于TAE 组（75%，χ2=6.465，P=0.011），差异有统计学意义，但与对照组（25%，χ2=0.476，P=0.490）差异无统计学意义，见表3。

图4 癌旁组织病理学改变

表3 癌旁组织中各蛋白免疫组化阳性结果

3 讨论

TAE 术中最重要步骤是向肿瘤动脉内注射栓塞剂，碘化油栓塞剂可在肝癌病灶内沉积，存留2～6 个月。由于肝脏内侧支循环丰富，栓塞剂也会通过侧支循环扩散至癌旁正常肝组织并沉积，大约2 周后才能被清除，因此栓塞剂可能会导致癌旁正常肝组织缺血缺氧，出现不同程度的炎性反应和细胞损伤。NF-κB 和MMP-9 又与炎性因子释放密切相关，术后癌旁肝组织中的含量会升高［8］。 机体发生炎性反应时，NF-κB 可调控其信号通路下游炎性因子肿瘤坏死因子（TNF）-α 和白细胞介素（IL）-10 合成和表达，打破促炎、抗炎平衡，引起靶细胞坏死和组织损伤［9］。MMP-9 除了可增强 IL-8 中性粒细胞趋化活性，其表达量还与肿瘤恶性程度密切相关［10-11］。MMP-9 可增强肿瘤细胞黏附性、加速正常细胞外基质降解、 配合其他酶类损伤癌旁正常组织血管，还可与磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican，GPC）-3 结合，促进癌细胞生长，在肿瘤增殖、袭击和转移过程中具有重要作用［12-13］。有研究表明，跨膜糖蛋白CD147在肝细胞癌中高表达，参与了癌细胞代谢，可通过激活p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路抑制脂肪酸的β-氧化，从而下调PPAR-α，而PPAR-α下调加速癌细胞增殖和转移［14］。 因此，检测癌旁组织中 PPAR-α、NF-κB 和 MMP-9 表达，可反映手术治疗效果，评估癌旁组织损伤、肿瘤发生侵袭和转移风险。

本研究结果显示TAE 组、 联合治疗组模型兔ALT、AST 水平显著高于对照组，提示 TAE 术确实会对肝功能造成一定程度的影响，这与以往研究结果相似；而应用了匹立尼酸的联合治疗组ALT、AST水平又低于TAE 组，提示匹立尼酸一定程度上减轻了TAE 术对肝脏的损伤，起到保护肝功能的作用。

同时，实时荧光定量聚合酶链反应分析结果显示，联合治疗组癌旁组织中PPAR-α mRNA 表达水平和免疫组化细胞阳性率均显著高于对照组和TAE 组，提示注射匹立尼酸确实可有效地上调肝脏癌旁组织中 PPAR-α 表达，这与 Brocker 等［15］在小鼠模型中研究结果类似，说明匹立尼酸确实可上调肝脏中PPAR-α 表达；联合治疗组癌旁组织中NF-κB mRNA 表达水平和免疫组化细胞阳性率显著低于TAE 组，但与对照组无差异，提示PPAR-α表达上调可抑制癌旁组织中NF-κB 表达，这与Fang 等［16］在小鼠模型中研究结果相似；联合治疗组癌旁组织中MMP-9 mRNA 表达水平和免疫组化细胞阳性率显著低于TAE 组，但与对照组无差异，提示NF-κB 表达下调可抑制 NF-κB 信号通路下游MMP-9 表达，这与 Zhu 等［17］、Jiang 等［18］研究结果相符。 Stomatin 样蛋白-2 是近年新发现的肿瘤相关线粒体内膜蛋白，其在肝癌组织中高表达，沉默其对应基因时可显著降低NF-κB 和MMP-9 表达，抑制肝癌细胞活力，降低其迁移能力和侵袭能力［17］。 近期有研究表明二甲双胍和氟西汀作为临床常用药物还具有抑制肝癌细胞MMP-9 表达的作用，二甲双胍可阻断NF-κB 核易位及其下游基因MMP-9 与uPA 启动子结合，氟西汀可通过抑制ERK/NF-κB 表达，降低肝癌细胞抗凋亡能力和侵袭力；此外，二甲双胍还可增强索拉非尼抗转移作用，因此联合应用二甲双胍、氟西汀等临床常用药物是否可增强匹立尼酸抑制NF-κB 信号通路及其下游MMP-9 表达，可作为今后肝癌TAE 术治疗用药方案的研究方向［19-20］。

综上所述，本实验在VX2 肝癌兔模型上验证了PPAR-α 激动剂匹立尼酸缓解肝癌TAE 术后癌旁组织炎性反应和肝功能损伤的有效性，其机制可能是匹立尼酸可促进 PPAR-α 表达，抑制 NF-κB 信号通路及其下游MMP-9 表达。 本实验为肝癌TAE 术后减轻肝损伤、 保护肝功能提供了新方案和新思路，为改善肝癌患者TAE 术后生存质量提供了新的理论依据。