RP-HPLC法测定济生肾气胶囊中丹皮酚的含量

刘海英，吴 晨，秦红霖

济生肾气胶囊是由熟地黄、牡丹皮、山茱萸、山药、茯苓、泽泻等十位中药，经煎煮提取加工而成的内服制剂，临床常用于肾虚水肿、腰膝酸重的治疗。济生肾气胶囊由北京军区北戴河疗养院研发此制剂，但原标准中无含量测定，丹皮酚是该处方的活性成分[1-2]，为更好对该制剂进行质量控制，本研究建立了济生肾气胶囊丹皮酚反相高效液相色谱(RP-HPLC)含量测定方法。现报告如下。

1 材料与仪器

1.1仪器设备 Agilent 1200 Series高效液相色谱仪(美国Agilent)。

1.2材料与试药 丹皮酚对照品(中国食品药品鉴定研究院，批号：0708-9704)，济生肾气胶囊(北京军区北戴河疗养院制剂室制备，批号：130624、131024、131123)甲醇为色谱纯，水为自制纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1丹皮酚测定色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)，柱温为30℃；流动相：甲醇-水(55∶45)；检测波长为274 nm；流速为1.0 ml/min；进样量为10 μl。

2.2溶液配制

2.2.1对照品溶液配制：精密称取丹皮酚对照品适量，置棕色量瓶中，加适量甲醇制成浓度为51.5 μg/ml的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 ml置于10 ml棕色量瓶中，作为浓度为15.45 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液配制：取装量差异项下内容物，混合，研磨均匀，取3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，加热回流2 h，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过即得。

2.2.3阴性对照溶液配制：按处方中药材比例，去除牡丹皮外的其他药材，按供试品溶液配制的工艺流程制备成不含牡丹皮的阴性对照溶液，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液10 μl进样检测。

2.3专属性试验 取丹皮酚对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，按2.1方法检测，采用DAD全波长扫描，结果显示丹皮酚出峰时间为49.273 min,阴性对照溶液未见明显杂质峰干扰，表明济生肾气胶囊组方中的其他成分在该色谱条件下对丹皮酚的含量测定未产生影响。理论塔板数按丹皮酚峰计>5000，丹皮酚与相邻峰的分离度>1.5。记录色谱图。见图1。

图1 济生肾气胶囊的反相高效液相色谱图

2.4线性关系考察 精密吸取51.5 μg/ml丹皮酚对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml分别置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各取10 μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标作图，得到标准曲线回归方程和相关系数：Y=86.3633X(r=0.9995)。结果表明丹皮酚在2.575～25.75 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5进样精密度考察 取浓度为51.5 μg/ml对照品溶液，按照2.1项下的色谱条件连续进样6次，丹皮酚色谱峰面积的流速精密度(RSD)为0.29%，仪器精密度符合要求。

2.6稳定性考察 取供试品溶液(批号130624)，按照2.1项下的色谱条件进行分析，分别于0、3、5、8、10、12 h进样6次，结果表明丹皮酚峰面积的RSD 为0.30%，符合要求。

2.7重复性试验 取同一批次(批号130624)济生肾气胶囊，按照2.2.2 项下的方法制备供试品溶液6份，并按照2.1项下的色谱条件进行测定。结果表明，丹皮酚的平均含量为0.0648 mg/g，RSD为0.95%，重复性较好。

2.8加样回收率试验 精密量取已知含量的济生肾气胶囊(批号：130624)9 份，每份1.5 g，分别精密加入对照样品溶液相当于中丹皮酚含量的100%，每个浓度平行做3 份，按2.1项色谱条件测定，计算回收率。见表1。

表1 济生肾气胶囊中丹皮酚的加样回收率试验结果

2.9样品含量测定 按2.2项下方法制备丹皮酚对照品溶液和济生肾气胶囊样品溶液，分别取上述对照品溶液和样品溶液各10 μl 进样，依照2.2项下色谱条件分析，外标法以峰面积计算样品中丹皮酚含量，共测定3批样(130624、131024、131123)，含量为(0.0648、0.0644、0.0523)mg/g。

3 讨论

丹皮酚定量的方法较多，如恒电流库仑法、紫外分光光度法、但这些方法前处理方法复杂[3-5]。利用HPLC的高分离性能，可以使丹皮酚与其他成分有效分离，快速测定多成分中药制剂中丹皮酚的含量[6]。HPLC是色谱技术的分支，液体作为流动相，高压输注系统将极性不同单一溶剂或不同溶剂和缓冲液的混合物的流动相泵送至固定相，在色谱柱中的组分分离后，色谱柱进入检测器进行检测，从而实现品的分析[7-8]。用丹皮酚对照品溶液在190～600 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果在274 nm波长处有最大吸收峰，且干扰较小，故确定检测波长为274 nm[9-10]。本研究曾尝试使用不同浓度的甲醇作为溶剂，超声、加热回流提取丹皮酚[11-12]，结果显示加热回流2 h提取效果较超声效果显著。用甲醇作为溶剂时，峰面积和峰形效果最佳。因此确定以甲醇作为溶剂，加热回流2 h作为提取条件。

在HPLC色谱条件研究中，对流动相进行了相关考察，参考文献所用流动相比例为甲醇-水-冰乙酸(50∶50∶1)[13]，甲醇-水(80∶20)[14]，甲醇-水(45∶55)[1，15]，不同甲醇和水的比例对峰形、拖尾、分离度有较大影响，经反复调整比例，最终确立甲醇-水(55∶45)为该制剂的色谱条件。另外，笔者对不同厂家柱子进行了相关考察，结果表明耐用性良好。

综上所述，采用RP-HPLC法测定济生肾气胶囊中丹皮酚含量，操作方法简单、准确、快速且重复性好、结果可靠，可以为该胶囊质量控制和质量评价提供参考。