CD15及Ki-67表达水平与乳腺癌患者病理参数及5年存活率的关系分析

沈 玲，李海滨，罗玉群，杨 辉

据统计，我国每年约有27万女性被确诊为乳腺癌，是女性最多发的恶性肿瘤[1]。乳腺癌起源于腺上皮的异常增生，是一种血管依赖性肿瘤，在其增殖、转移过程中需经过内皮细胞增殖、侵入、成熟、分化阶段形成新的毛细血管网，是一个多基因、多因子的作用过程[2-4]。探讨乳腺癌发生发展的分子机制及寻找相关特异性标志物一直是临床研究的热点问题[5-6]。细胞黏附分子(CAMs)是一类位于细胞表面的糖蛋白分子，与恶性肿瘤的发展相关，CD15是CAMs的配基之一[7]。Ki-67是细胞增殖的标志指标，经常用来预测恶性肿瘤患者的预后情况[8]。本研究检测了乳腺癌肿瘤标本中CD15、Ki-67的表达情况，评估了二者与乳腺癌患者临床病理学参数和存活率之间的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年5月—2015年5月我院收治的乳腺癌患者手术切除的石蜡标本和癌旁正常组织(距病变部位>5 cm处，且证实为无癌浸润)石蜡标本各90例为研究对象。癌组织和癌旁组织全部取样于女性，年龄37～68(49.64±4.09)岁；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期50例，Ⅲ期19例；浸润性导管癌71例，导管原位癌10例，其他类型9例。

1.2纳入及排除标准

1.2.1纳入标准：①参照《新编常见恶性肿瘤诊治规范》[9]，由术后病理学确诊为乳腺癌的患者，可以明确肿瘤大小、部位、浸润程度；②既往未接受过乳腺癌根治术和放化疗的患者。

1.2.2排除标准：治疗期间死亡患者；合并其他恶性肿瘤患者；孕妇；伴随肺间质疾病或严重肝肾功能障碍者；患有血液系统疾病或传染病等。

1.3免疫组化 采用EnVision TM二步法检测系统进行检测。

1.3.1切片制备：4 μm厚石蜡组织切片行常规苏木精和伊红染色复染确认。切片经烤片、脱蜡、水化后，TBST冲洗3 min×3次。

1.3.2抗原热修复：将切片浸泡于柠檬酸盐热修复液中，经高压煮沸2 min，然后室温放置自然冷却。TBST冲洗一次。

1.3.3阻断内源性过氧化物酶：甩去TBST液，每张切片滴加3% H2O2溶液，室温下孵育10 min。甩去3% H2O2溶液，TBST冲洗3 min×3次。

1.3.4封闭非特异性结合：甩去TBST液，每张切片滴加5%BSA溶液，室温孵育1 h。甩去5%BSA液，每张切片滴加100 μl相应的一抗∶羊抗人CD15(1∶100)单克隆抗体，兔抗人Ki-67单克隆抗体(1∶100)，将切片置于室温下孵育1 h。甩去一抗：TBST冲洗3 min×3次。每张切片上滴加100 μl新鲜配制的DAB显色溶液，在显微镜下观察其显色情况，显色时间为2～3 min。自来水冲洗终止显色，苏木素复染3 min，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗返蓝5 min。梯度乙醇脱水干燥、二甲苯透明后，中性树胶封固。显微镜下观察结果。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知的CD15、Ki-67阳性标本为阳性对照。

1.4阳性判定标准 观察高倍镜(×400)视野下阳性细胞百分数及染色强度：阳性细胞≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，≥76%计4分；细胞未染色计0分，淡黄色为1分，棕黄为2分，棕褐为3分；总分=细胞染色评分×细胞占比评分，总分≥3分即为阳性表达[9-10]。结果评判由2人进行双盲读片确定。

2 结果

2.1不同组织CD15、Ki-67表达情况 乳腺癌组织CD15、Ki-67的阳性表达率分别为73.33%(66/90)、71.11%(64/90)，癌旁组织CD15、Ki-67的阳性表达率分别为25.56%(23/90)、31.11%(28/90)。乳腺癌组织中CD15、Ki-67阳性表达率均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 乳腺癌组织中Ki-67、CD15表达情况(SP×400)

2.2CD15、Ki-67表达与乳腺癌临床病理的关系 TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、合并淋巴结转移、出现神经侵犯、肿瘤直径≥2 cm的乳腺癌患者CD15、Ki-67表达水平均较高，差异有统计学意义(P<0.05)。不同类型的乳腺癌组织Ki-67阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)；但不同年龄、肿瘤分化程度、绝经情况的乳腺癌患者肿瘤组织中CD15、Ki-67阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 CD15、Ki-67表达与乳腺癌患者临床病理的关系[例(%)]

2.3乳腺癌组织中CD15、Ki-67表达相关性分析 66例CD15阳性表达的乳腺癌，Ki-67总阳性率为90.91%(60/66)、阴性率为9.10%(6/66)；经Spearman相关性分析可知，乳腺癌组织中CD15与Ki-67表达呈正相关(r=0.406，P=0.008)。

2.4CD15、Ki-67表达与乳腺癌5年生存率的关系 90例乳腺癌患者的总生存率为64.44%(58/90)。CD15、Ki-67阳性乳腺癌患者5年生存率均低于CD15、Ki-67阴性者(P<0.05)。见表2。不同CD15、Ki-67阳性表达乳腺癌患者术后5年生存率曲线见图2。

表2 CD15、Ki-67表达与乳腺癌患者5年生存率的关系

图2 不同CD15、Ki-67表达乳腺癌患者生存曲线

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，近年来随着人们饮食结构和生活习惯的改变，其发病呈年轻化趋势[11]。虽然乳腺癌的早期检测手段和治疗方法多样，但仍有10%的早期患者未能完全治愈，对其身心健康造成了严重影响[12-14]。相关专家对乳腺癌的产生、发展相关的因子进行了筛选、研究，但关于乳腺癌蛋白的表达及其与临床病理意义、中远期预后相关性的研究报道较少。本研究采用免疫组化检测了90例乳腺癌组织中CD15、Ki-67的表达情况，旨在从蛋白质分子水平认识乳腺癌。

Ki-67是一种与细胞增殖联系密切的抗原，经常用于恶性肿瘤增殖能力、增殖程度的评估。贾磊等[15]回顾性分析了肝细胞癌根治手术患者的免疫组化结果，以5年是否复发作为评价标准，其研究结果显示，CD34、Ki-67的高表达预示该类患者术后复发风险更高，提示Ki-67与肿瘤细胞的增殖能力、生长方式、转移等多种生物学行为有联系。除此之外，Ki-67在指导乳腺癌患者的临床治疗、药物疗效预测、预后评估方面均有较高的参考价值[16-17]。本研究中利用免疫组化法检测肿瘤组织中Ki-67的表达情况，结果显示，乳腺癌组织中Ki-67的阳性率显著高于癌旁组织；同时Ki-67的阳性率与乳腺癌的TNM分期、神经侵犯、肿瘤大小、肿瘤类型、淋巴结转移相关，提示Ki-67上调与乳腺癌细胞较强的增殖、转移能力有关。

CD15抗原属CAMs成员，由半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖组成，经选择素识别后确定的CAMs配基之一，位于中性粒细胞表面。在人体正常组织中，CD15的表达并不一致，如在胃肠、肺泡、子宫黏膜上皮、乳腺导管上皮组织中的表达较高，而在食管、皮肤的鳞状上皮组织中呈低表达，在心肌、纤维组织等非上皮组织中不表达[18-19]。戚利坤等[20]研究指出，在乳腺癌组织中CD15的阳性表达率显著升高，且与癌的分化程度密切相关。本研究结果显示，CD15在乳腺癌组织中的阳性表达率明显升高，与乳腺癌的TNM分期、淋巴结转移相关，提示CD15的表达与肿瘤细胞的增殖、分化情况相关，推测是因为乳腺癌起源于腺上皮异常增生，恶变细胞和组织中结构紊乱，影响了CD15的正常表达。

本研究分析了乳腺癌患者CD15、Ki-67的相关性，结果显示，Ki-67的表达与CD15呈显著正相关，提示二者可相互调控，推测是Ki-67的上调，增强细胞生长与增殖能力，进而导致恶性肿瘤中CD15表达上调，促进肿瘤细胞侵袭、转移。同时，本研究中发现CD15、Ki-67的阳性表达的乳腺癌患者5年存活率显著低于阴性表达患者，与既往研究结论相似[21]，说明CD15、Ki-67对乳腺癌患者中远期的预后情况有一定的评估价值。

综上所述，CD15、Ki-67在乳腺癌中的表达上调，与肿瘤临床病理学指标密切相关；且二者表达呈显著相关性。由此推测，CD15、Ki-67的高表达提示乳腺癌的恶化程度较高，转移和侵袭能力强，中远期预后较差。