肝硬化门静脉高压症大鼠肠系膜上动脉重构的实验研究

郑 磊，林佳昀，张驰豪，赵治锋，李泓杰，戚晓亮，火海钟，罗 蒙

上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科，上海 200011

门静脉高压症（portal hypertension，PHT）是指由于门静脉系统的血液循环受阻导致门静脉压力（portal pressure，PP）升高，从而出现一系列如脾大、脾功能亢进、血液系统三系减少、直肠和脐周浅静脉曲张、食管胃底静脉曲张（esophageal and gastric varices，EGV）、腹水等临床表现的综合征[1-3]。在我国，由于肝移植受多方面因素的制约，其尚未被作为治疗肝硬化PHT 的主要方式，因此绝大多数病例仍需进行内外科综合治疗[4-5]。所以，针对PHT 发病机制的研究，探索有效的PHT 治疗靶点至关重要。

肝脏出现不可逆的硬化是引起PHT 的始动因素[6]。在PHT 中，PP 的逐渐升高可引起门脉系统血管中众多机械力如内皮拉伸力、血管壁张力和流体剪切应力等的增加，一氧化氮（nitric oxide，NO）产生的增多，进而导致脾大及肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA）对缩血管物质的低反应性，从而引起内脏循环血量增多，引发高动力循环综合征并促进广泛侧支循环形成[7-8]。而动脉重构是由于长期血流动力学参数的改变和机械力作用导致血管结构发生变化，包括动脉壁弹性的快速调节、动脉结构重塑的慢性调节等[9-10]。已有研究[11]表明，肝硬化PHT 患者的腹主动脉发生顺应性改变，以管壁变薄、每个截面积细胞数量变少为特征。因此，本研究针对肝硬化PHT 发病机制中的SMA 重构的具体表型进行探讨，以期为PHT患者的综合治疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 实验动物、主要仪器及试剂

SPF 级 健 康 雄 性Sprague-Dawley 大 鼠26 只[ 由 上海杰思捷实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证：SCXK（沪）2018-0004]，体质量为250 ～300 g。该大鼠饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房的标准饲养笼中，实验动物使用许可证：SYXK（沪）2016-0016。所有大鼠饲以钴-60 辐照灭菌标准干颗粒饲料，于温度约25℃、湿度60%～70%、12 h 光照与黑暗交替条件下，自由进食、饮水。本研究根据上海交通大学医学院附属第九人民医院动物伦理委员会指导，按照《实验动物管理条例》对动物进行操作。

四氯化碳（CCl4）（国药集团化学试剂有限公司），苯巴比妥（Sigma，美国），苏木精伊红液、马松（Masson）染液、天狼星红（Sirius Red）染液（上海碧云天生物技术有限公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、弹性蛋白抗体、钙调蛋白抗体、cleaved caspase-3 抗体（Cell Signal Technology，美国），Ki-67 抗体（Abcam，美国），RZ-6240E 四通道生物信号采集系统（上海脉永医疗科技有限公司），全自动生物组织包埋机、冻台（Leica，德国），正置光学显微镜、解剖显微镜及成像系统（Nikon，日本），荧光显微镜（Zeiss，德国），LEICA RM 2235 切片机（上海徕卡仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组和肝硬化PHT 大鼠模型制备 为观察肝硬化PHT 不同严重程度对SMA 重构表型的影响，本研究将大鼠分为正常对照组（Normal group）8 只、CCl4吸入8周PHT 组（CCl48 w group）8 只、CCl4吸入12 周PHT 组（CCl412 w group）10 只。对于CCl4吸入8 周及12 周组大鼠：将CCl4溶液置入容器中，一边接入流动空气，一边接入饲养笼。大鼠平均每次吸入CCl4的时间为1 ～2 min，前3 周吸入CCl4的时间为3 ～5 min，每周2 次；饮用苯巴比妥水（0.3 g/L）。正常对照组大鼠则采用不给予含CCl4溶液的空气，每周2 次，正常饮水。后续，可通过检测3 组大鼠的血流动力学参数、观察其肝脏的形态及结构，判断模型构建是否成功。

1.2.2 大鼠血流动力学参数测定 称重后，用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉3 组大鼠。根据大鼠股动脉搏动情 况确定股动脉走行，在游离股动脉约2 cm 处结扎远心端，并用动脉夹夹闭近心端。用肝素钠生理盐水溶液（100 U/mL）充满22 G 静脉留置针后，将其插入股动脉，松开动脉夹，用丝线结扎并固定针管和股动脉近心端，针管另一端则与肝素化的压力换能器相连，通过RZ-6240E四通道生物信号采集系统读取并记录平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）。而后，从正中切口进腹，将肝脏上翻，沿肠系膜找到门静脉主干，将PE-50 导管平行刺入门静脉1.5 cm 左右，其另一端与肝素化的压力换能器相连。平衡10 min 后，通过RZ-6240E 四通道生物信号采集系统读取并记录PP。

1.2.3 大鼠SMA 获取 取出所有大鼠的肝脏组织，双手游离暴露整段肠系膜环。用血管钳钳夹肠系膜与后腹壁连接处，在钳夹处远端剪下肠系膜及整段肠管，并将其迅速置入生理盐水溶液中。随后，用针头将其固定于培养皿中的硅胶板上，最大程度地暴露SMA 及其分支。去除淋巴结和脂肪后，缓慢分离SMA，并将中段SMA 置于4%多聚甲醛中，以备后续行免疫组织化学和免疫荧光检测；剩余部分SMA 保存于液氮中，以备后续行蛋白质印迹（Western blotting）检测。

1.2.4 相关指标检测 取上述肝脏组织制备石蜡切片，而后分别行苏木精- 伊红染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色）、Masson 染色和Sirius Red 染色，以观察肝脏结构。取上述获取的SMA 组织制备冰冻切片后行H-E 染色，观察其血管直径、血管壁厚度和血管面积。采用免疫组织化学法检测中段SMA 中钙调蛋白的表达。采用免疫荧光法检测中段SMA 中弹性蛋白、cleaved caspase-3 蛋白及Ki-67 蛋白的表达，并采用Western blotting 检测保存于液氮中SMA 的钙调蛋白和弹性蛋白的表达。

1.3 统计学方法

应用Image J 软件定量分析SMA 的血管直径、血管壁厚度和血管面积等参数，免疫组织化学结果和Western blotting 结果。应用Zessi 2.6 软件分析免疫荧光结果，并用Image J 软件定量分析。应用SPSS 20.0 软件对研究数据进行统计分析，组间两两比较采用t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝硬化PHT 模型的建立

本研究通过对3 组大鼠进行不同方式的处理后发现：①正常对照组大鼠生长发育良好，毛发有光泽，抓持时皮肤有弹性，挣脱力较大；而CCl4吸入8 周和12 周的肝硬化PHT 组大鼠，随着吸入时间的增加，毛发变得稀疏，精神逐渐发生萎靡，挣脱力明显减弱，且部分大鼠产生了明显的腹水（图1A）。②正常对照组大鼠肝脏形态规则，表面光滑，颜色红润且质地柔软；CCl4吸入8 周的肝硬化PHT 组大鼠肝脏颜色变灰黄，表面多不规则；而CCl4吸入12 周大鼠的肝脏整体缩小，形态不规则，表面可见颗粒状结节，颜色变至暗灰色，质地较硬，失去光泽（图1B）。③经CCl4吸入诱导建模后，与正常对照组相比，CCl4吸入8 周和12 周的肝硬化PHT 组大鼠的PP 升高、MAP 降低（均P＜0.05）（图1C、D）。

图1 大鼠肝硬化PHT 模型的建立Fig 1 Establishment of PHT model of liver cirrhosis in rats

对3 组大鼠的肝脏组织的石蜡切片行H-E 染色，结果显示：3 组组织的细胞核呈蓝色、细胞质呈红色。正常对照组大鼠肝脏组织形态正常，以小叶中央静脉为中心排列成放射状细胞条索。CCl4吸入8 周和12 周组大鼠肝脏可见弥漫性肝窦和肝小叶结构的破坏，纤维和胶原组织在汇管区，圆形或类圆形的假小叶形成；其中，CCl4吸入12 周组较8 周组更甚，假小叶内肝细胞成团排列，未见正常肝窦结构，血管及假小叶周围有炎细胞浸润。经Masson 染色后，结果显示：3 组肝脏组织的胶原纤维呈蓝色。Sirius Red 染色后结果显示：3 组肝脏组织的胶原纤维呈红色，背景黄色。相较于正常对照组，CCl4吸入8 周组和12 周组大鼠的肝脏组织切片可见弥漫性胶原纤维组织广泛增生，主要分布于假小叶周围；其中，CCl4吸入12周组较8 周组硬化更加严重，同时在肝窦、门脉、肝动脉和中央静脉周围有大量的胶原纤维沉积（图1E）。综上，大鼠肝硬化PHT 模型构建成功。

2.2 大鼠SMA 重构分析

SMA 冰冻切片经H-E 染色后发现，正常对照组大鼠SMA 弹性较好，镜下结构正常，分为内皮细胞（endothelial cell，EC）层、平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）层和动脉外壁层。EC 层表面光滑，基底膜完整，细胞间隙之间连接紧密；SMC 层呈梭形排列成束，胞质中可见明显肌丝；动脉外壁层可见弹性纤维、胶原纤维以及疏松结缔组织排列规则。CCl4吸入8 周组大鼠的动脉结构出现损坏，整体血管层次不清，有变薄倾向。在CCl4吸入12 周组，大鼠的血管EC 层基底膜不完整，细胞间隙连接较疏松，SMC 明显减少，胞质中肌丝少且紊乱，部分肌丝出现断裂，SMA 明显变薄（图2A、B）。经Image J 软件定量后结果（图2C ～F）显示：与正常对照组相比，CCl4吸入12 周组大鼠的SMA 管壁厚度变薄（P=0.000）、管壁厚度和直径比率下降（P=0.002）及整体血管壁面积减少（P=0.009）；3 组大鼠的SMA 管腔直径间差异虽无统计学意义，但CCl4吸入12 周组和吸入8 周组较正常对照组略有增加。

2.3 大鼠SMA 中钙调蛋白表达的检测

采用免疫组织化学法检测中段SMA 结构中钙调蛋白的表达情况。结果（图3A ～C）显示，CCl4吸入12 周组较正常对照组的棕色区域明显减少，即钙调蛋白表达下降；经Image J 软件定量后显示，该差异有统计学意义（P=0.003）。采用Western blotting 检测剩余SMA 亦得到了同样的结果（图3D）。

2.4 大鼠SMA 中弹性蛋白表达的检测

图2 大鼠SMA 重构分析Fig 2 Analysis of SMA reconstruction in rats

采用免疫荧光法检测中段SMA 结构中平滑肌层重要组成成分弹性蛋白的表达。结果（图4A ～C）显示：与正常对照组和CCl4吸入8 周组相比，CCl4吸入12 周组大鼠的阳性信号（红色）较弱，即弹性蛋白表达减少；经Image J 软件定量后显示，CCl4吸入12 周组与正常对照组间差异具有统计学意义（P=0.018）。采用Western blotting检测剩余SMA 亦得到了同样的结果（图4D）。

图3 免疫组织化学法和Western blotting 检测3 组大鼠SMA 中钙调蛋白的表达水平Fig 3 Expression levels of caldesmon in SMA among the three groups of rats by immunohistochemistry and Western blotting

2.5 大鼠SMA 中cleaved caspase-3 蛋白、Ki-67 蛋白表达的检测

图4 免疫荧光法检测3 组大鼠SMA 中弹性蛋白的表达水平Fig 4 Expression levels of elastin in SMA among the three groups of rats by immunofluorescence

以cleaved caspase-3 蛋白水平作为凋亡信号，采用免疫荧光法检测其在3 组大鼠中段SMA 中的表达，结果（图5A、B）显示：与正常对照组相比，CCl4吸入12 周组大鼠的中段SMA 中的EC 层、SMC 层和动脉外壁层中的cleaved caspase-3 蛋白表达细胞均有所增加（均P=0.000），即凋亡信号增强，其中以SMC 层增加最为明显。以Ki-67蛋白水平作为增殖信号，采用上述方法检测其在各组中段SMA 中的表达，结果（图5C、D）显示：与正常对照组 相比，CCl4吸入12 周组大鼠的中段SMA 中各层增殖信号均有所增加，且在EC 层和动脉外壁层中较为显著（均P=0.000）。

3 讨论

图5 免疫荧光法检测3 组大鼠SMA 中cleaved caspase-3 蛋白和Ki-67 蛋白的表达水平Fig 5 Expression levels of cleaved caspase-3 and Ki-67 protein in SMA among the three groups of rats by immunofluorescence

肝硬化PHT 的基础研究主要集中在肝内和肝外两部分。对于肝内部分，研究旨在缓解肝硬化的进一步发展，减少肝内的纤维生成，降低肝内血管阻力，从而降低PP；对于肝外部分，研究则主要致力于减少内脏血管高动力循环，改善SMA 的血管扩张以及对血管舒张物质的低反应性。本研究结果表明：CCl4诱导的肝硬化PHT 模型不仅存在较高的PP，肝脏结构也出现了硬化改变；同时除了SMA 存在上述血管扩张等功能性改变外，该模型亦存在血管重构等结构性改变。

不仅如此，本研究还发现肝硬化PHT 大鼠SMA 中的钙调蛋白表达下降，而研究[12]发现依赖钙调蛋白的肌球蛋白磷酸化作用即粗肌丝调节是血管平滑肌收缩的重要环节。钙调蛋白是一种多功能的钙结合蛋白质，含150 个氨基酸，结构相对保守，对钙具有高度亲和性；该蛋白能结合肌动蛋白共存于细肌丝中，还可通过可逆的磷酸化、去磷酸化反应抑制肌球蛋白ATP 活力[13]。在本研究中，SMA 变薄主要发生在血管SMC 层，因此钙调蛋白表达下降可能是导致血管SMC 层结构和功能变化的关键点。上调钙调蛋白的表达可引起SMA 钙信号增强以及下游基因转录，从而促进血管恢复收缩功能，减缓血管扩张，减轻血管重构对肝硬化PHT 带来的不利影响。

弹性蛋白是一种既耐酸又耐碱的细胞外高分子基质蛋白[14]。目前已经证明其在脑血管疾病中有重要作用，如脑动脉瘤、动脉粥样硬化、烟雾病等。弹性蛋白是构成弹性膜或弹性纤维的成分之一，亦是动脉壁的主要成分，具有动脉伸缩、舒张功能，在正常压力下可支撑血管以拮抗管壁塌陷。同时，该蛋白可减缓血流对血管的冲击力，从而降低血流阻力、剪切力、循环应变力等，在弹性动脉中起到稳定血流的作用[15]。此外，弹性蛋白还具有调控SMC 和稳定动脉构筑的功能[16]。研究[17]发现，大鼠的主动脉弹力层由6 ～10 层弹性蛋白构成，而人主动脉则由40 ～70 层构成。离体和在体实验[18]表明，物理因素（包括血压、血流、外伤等）、细胞因子、生长因子、药物和激素等均可影响动脉弹性蛋白的合成。本研究发现其在肝硬化PHT 的SMA 中同样发生大面积减少，继而提示SMA 重构与弹性蛋白相关。所以，肝硬化PHT 大鼠SMA中弹性蛋白的合成减少，将会引起血管壁的变薄、收缩功能的减弱，从而加剧PHT 的发展。因此，增加以弹性蛋白为主要结构的平滑肌层，应当成为改善PHT 动脉重构的关键。

本研究发现肝硬化PHT 的SMA 血管壁存在不同程度的凋亡和增殖，但SMC 层凋亡信号较强且差异具有统计学意义。正常血管与淋巴管一样，由EC 层、SMC 层和血管外壁层共同组成，存在一定的渗透压，能够维护组织稳态，具有较好的屏障作用。而在本研究中，肝硬化PHT大鼠SMA 的动脉血管的结构与功能发生变化，与正常对照组间存在较大差异。因此，动脉壁的变薄，尤其是凋亡增多导致SMC 层的急剧减少，各功能蛋白和收缩蛋白表达下降，肝外SMA 形态和结构逐步类似淋巴管，均可能是肝硬化PHT 患者腹水增多的原因。

综上所述，肝硬化PHT 的肝外SMA 存在血管重构变薄现象，且相关收缩结构蛋白如钙调蛋白、弹性蛋白的表达均急剧下降，平滑肌层凋亡增多，受损严重。因此，如何调控PHT 的动脉重构对其血流动力学参数的影响，从而降低PP、缓解肝硬化PHT 的发生与发展将是我们未来研究的重点；同时，对该方向的深入探讨也或可为肝硬化PHT 患者的外科综合治疗提供新的思路。

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