皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌组织中VEGF、COX-2及ID-1的表达及临床意义

黄林，陈江艳

（重庆市江津区中心医院 1.皮肤科，2.肿瘤科，重庆 402260）

鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）及基底细胞癌（basal cell carcinoma, BCC）是皮肤恶性肿瘤中最常见的亚型，近年来发病率逐年升高，需要引起高度重视[1]。SCC、BCC 的发病早期无明显临床表现，当出现特异性改变时往往已处于中晚期，极易贻误有效治疗时机。同时，SCC 与BCC 的治疗方法存在差异，且早期鉴别诊断较困难。因此，寻求疾病的早期诊断方法有利于鉴别诊断并及时进行针对性治疗，从而提升预后质量。皮肤SCC、BCC 形成的重要环节是新生血管的形成，既往研究表明，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）及分化抑制因子-1（Inhibitor of DNA differentiation-1, ID-1）等可能对新生血管存在加速效应，对SCC、BCC 的形成具有促进作用[2]。本研究检测VEGF、COX-2 及ID-1 在皮肤SCC、BCC 中的表达，以探讨其临床意义和应用前景，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年3月—2019年3月重庆市江津区中心医院收治的皮肤恶性肿瘤患者76 例，SCC 组和BCC 组均38 例。其中，男性62 例，女性34 例；年龄30 ～73 岁，平均（63.64±6.30）岁。纳入标准：①恶性肿瘤经病理检查确诊；②临床资料完整且随访完成；③与患者进行详细沟通并签署知情同意书。排除标准：①已接受放疗等其他影响本研究的治疗；②受身体条件限制不适合研究或不配合研究；③存在心、肺等严重器官衰竭的症状。采用配对的方式选取30 例无恶性肿瘤的同期皮肤移植患者为对照组。SCC 组及BCC组的组织取材部位包括头皮、面部、四肢等，对照组的组织来源于皮肤移植的剩余材料。3 组患者的性别构成比、平均年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究经医院医学伦理委员会批准备案。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器兔抗人VEGF、COX-2、ID-1抗体购自英国Abcam 生物有限公司，磷酸盐缓冲液（PBS）、辣根过氧化物酶（HRP）、十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）购自北京科展生物科技有限公司，RT-PCR 仪、Invitrogen 凝胶成像系统购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

表1 两组患者术前基线资料的比较

1.2.2 免疫组织化学检测VEGF、COX-2 及ID-1的阳性表达率[3]对皮肤组织进行包埋、切片、脱蜡及抗原修复处理。一抗选用兔抗人VEGF、COX-2、ID-1 抗体，采用PBS 稀释，PBS 作为对照。二抗选用羊抗兔多克隆抗体，采用HRP 稀释，染色后封存处理。光学显微镜下细胞内检测出棕色颗粒为VEGF、COX-2 及ID-1 阳性表达。

1.2.3 RT-PCR 检测VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA的表达[4-5]对皮肤组织提取总RNA，行RT-PCR 检测。具体步骤：96℃预变性5 min，92℃变性2 min，55℃退火30 s，75℃延伸3 min；重复25 个循环获取PCR 产物。此后行电泳分离，并利用Invitrogen 凝胶成像系统对电泳各条带进行平均灰度值的测定，并与标准条带（β-actin）进行比较，以其比值作为mRNA表达的评价标准。

1.2.4 Western blotting 法 检 测VEGF、COX-2 及ID-1 的蛋白相对表达量[6-7]PBS 缓冲液冲洗皮肤组织，加入裂解液500 μl，低温15 000 r/min 离心3 min，留取上清液。加入SDS-PAGE 并转膜，封闭后在低温环境加入VEGF、COX-2 及ID-1 的一抗，摇床过夜后加入二抗，随后进行洗膜和显色以检测蛋白表达。以β-actin 为标准蛋白，测定VEGF、COX-2及ID-1 蛋白表达的绝对值及与标准蛋白的比值，以降低研究误差。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用例（%）表示，比较采用χ2检验和χ2分割法；相关性分析采用Pearson 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 阳性表达的比较

3 组VEGF、COX-2 及ID-1 的阳性表达见图1～3。3 组VEGF、COX-2 及ID-1 的阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，SCC组与BCC 组高于对照组（P＜0.05）；SCC 组高于BCC组（P＜0.05）。见表2。

图1 3 组VEGF 的表达 （SP×200）

图2 3 组COX-2 的表达 （SP×200）

图3 3 组ID-1 的表达 （SP×200）

2.2 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 及蛋白表达的比较

3 组VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 及蛋白表达的比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，SCC 组与BCC 组高于对照组（P＜0.05）；SCC组高于BCC 组（P＜0.05）。见表3、4 和图4、5。

2.3 SCC 组及BCC 组中VEGF、COX-2 及ID-1表达的相关性

对SCC组及BCC组中VEGF、COX-2 及ID-1的表达进行相关性分析，结果表明：VEGF 与COX-2呈正相关（r=0.353，P=0.027），VEGF 与ID-1 呈正相关（r=0.395，P=0.015），COX-2 与ID-1 呈正相关（r=0.437，P=0.007）。

表2 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 阳性表达的比较例（%）

表3 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 表达的比较（±s）

表3 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 表达的比较（±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与BCC 组比较，P ＜0.05。

组别 n VEGF mRNA COX-2 mRNA ID-1 mRNA SCC 组 38 0.93±0.13①② 0.71±0.10①② 0.92±0.12①②BCC 组 38 0.54±0.10① 0.62±0.12① 0.63±0.11①对照组 30 0.23±0.08 0.40±0.09 0.18±0.08 F 值 241.033 8.690 8.648 P 值 0.000 0.009 0.009

表4 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 蛋白表达的比较 （±s）

表4 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 蛋白表达的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与BCC 组比较，P ＜0.05。绝对值为蛋白水平，比值为蛋白水平与标准蛋白β-actin 水平的比值。

VEGF COX-2 ID-1绝对值 比值 绝对值 比值 绝对值 比值SCC 组 38 9.26±2.49 6.47±0.24①② 0.78±0.05①② 3.39±0.28①② 0.47±0.06①② 5.59±0.23①② 0.68±0.09①②BCC 组 38 9.33±2.27 4.96±0.22① 0.62±0.08① 2.48±0.27① 0.38±0.04① 4.11±0.21① 0.55±0.10①对照组 30 9.25±2.34 3.57±0.10 0.41±0.06 1.34±0.25 0.24±0.05 2.25±0.19 0.34±0.09 F 值 0.012 462.577 82.393 275.372 139.424 552.684 31.068 P 值 0.978 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别 n β-actin（标准值）

图4 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 的表达

图5 3 组VEGF、COX-2 及ID-1 蛋白的表达

3 讨论

SCC 与BCC 是皮肤科常见的难治性恶性肿瘤，其发病机制复杂，与多基因改变相关，且早期无特异性表现，当疾病确诊时往往已处于恶化的中晚期，不利于及时治疗及预后恢复[8-9]。因此，SCC 与BCC 的早期诊断较困难，需要研究预测其早期特异性改变的指标，以达到早期诊治、改善预后的目的[10-11]。

肿瘤增殖及转移过程的重要促进因素是新生血管的形成。VEGF 具有较好的促血管作用，可促进血管的新生并提升其通透能力，因此通过检测VEGF 水平可以较准确地预测肿瘤血管状况[12-13]。既往研究表明，在肺癌、十二指肠癌等多种恶性肿瘤中，VEGF 均呈高表达，且其成分与肿瘤的侵袭性具有相关关系[14-15]。COX-2 在炎症反应的发生与发展中发挥重要作用，另外，还参与肿瘤进展的多个重要环节，包括新生血管生成、诱导增殖并阻滞凋亡等；因此COX-2 可见于多种肿瘤[16-17]。ID 属于螺旋-环-螺旋（HLH）反式作用因子家族，可通过与碱性HLH 蛋白（bHLH）结合而抑制蛋白的分化转录[18-19]。既往基因组学研究表明，ID-1 可通过体内多种信号传导通路对癌细胞的发生、进展及凋亡过程产生干预，可特异性阻滞癌细胞周期，阻滞细胞增殖并诱导其凋亡，与体内原癌基因的效果类似[20]。

本研究结果表明，3 组VEGF、COX-2 及ID-1 的阳性表达率、mRNA 及蛋白表达的差异有统计学意义；SCC 组与BCC 组均高于对照组；SCC 组均高于BCC 组。以上结果与KARSTEN 等学者[21]的研究结果类似。

本研究对VEGF、COX-2 及ID-1 在SCC、BCC及对照组的表达水平进行检测，结果表明其变化规律类似，具有共同的表达趋势，可能存在相关关系，共同对疾病进行调节。为此本研究进一步对SCC 组及BCC 组中VEGF、COX-2 及ID-1 表达的相关性进行分析，结果表明，VEGF、COX-2 及ID-1 3 者之间的表达均呈正相关。可见VEGF、COX-2 及ID-1 联系密切，采用联合检测的手段有利于SCC、BCC 疾病的精确诊断，尤其对早期诊断具有重要的临床意义[22-23]。

本研究结果提示VEGF、COX-2 及ID-1 的表达存在协同效应。在疾病诊断中可考虑检测VEGF、COX-2 及ID-1 以对肿瘤恶性程度和进展能力进行有效评估，尤其适宜用于早期诊断。治疗中可考虑通过阻滞ID-1 的表达过程和活化VEGF 以抑制肿瘤新生血管的生成，可能对干预肿瘤的细胞周期、阻滞肿瘤的进展具有一定作用[24]。这一点有待于长时程、大样本量的临床研究。

综上所述，皮肤SCC 与BCC 的发生、发展与VEGF、COX-2 及ID-1 的高表达有关，且3 者的表达呈正相关，有利于促进肿瘤新生血管的形成并诱导转移。因此，联合检测VEGF、COX-2 及ID-1 的表达对皮肤SCC 与BCC 具有重要的早期诊断意义，同时阻滞其表达通路有利于抑制疾病的进展，具有较好的临床意义。