瞬时弹性成像技术(FibroScan)检测和血miR-21水平与乙肝肝硬化患者肝脏纤维化程度的关系及对预后的预测

栗红江， 胡素玲*， 何久胜， 何福亮， 刘震霞

(1. 保定市人民医院， 河北 保定 071000； 2. 保定市中心血站， 河北 保定 071000；3. 首都医科大学附属北京友谊医院， 北京 100050)

乙型肝炎是临床常见慢性传染性疾病，发病率较高，截至2018年，全球约2.4亿乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，HBV)感染者[1]。HBV持续侵害可致肝细胞变性、坏死，最终发展为乙肝肝硬化(hepatitis B cirrhosis，HBC)，而大部分代偿期HBC无特异性症状，且多数生物学指标正常，较难发现，一旦进展至失代偿期则常出现消化道出血、肝衰竭等严重继发症状。临床已证实，肝脏纤维化是HBC进展的主要病理生理过程，但常规肝纤维化诊断方式主要是活检，属有创操作，可重复性差，且易受个体性因素影响[2]。瞬时弹性成像技术(FibroScan)是基于超声基础发展起来的一种影像学检查手段，可通过肝脏弹性测量值反映肝脏纤维化程度，但其难以反映肝脏炎症及坏死情况[3]；miR-21是广泛存在于人体内的miRNA家族成员，有研究表明，在慢性肝炎、HBC患者体内miR-21异常表达，或可从微观层面为临床评价HBC发病发展提供参考[4]。

本研究探讨了FibroScan技术和血miR-21水平与HBC患者肝脏纤维化程度的关系及对预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月～2018年12月保定市人民医院HBC患者92例为病例组，同期92例慢性乙型肝炎患者为对照组。纳入标准：符合HBC和慢性乙型肝炎诊断标准[5,6]；通过肝穿刺活检确诊，病例组为失代偿期肝硬化；病因学明确HBV感染证据，结合病史及对应检查排除酒精、药物等引起肝炎和肝硬化者；患者、家属知情本研究并签署同意书。排除标准：伴严重其他部位感染者；哺乳及妊娠期女性；合并肝外胆道梗阻性疾病、免疫性疾病、代谢性疾病者。两组患者年龄、性别、体质量指数、饮食习惯、现病史、乙肝家族史等基础资料均衡可比(P>0.05)。详见表1。

表1 两组患者一般资料对比

1.2 方法

FibroScan检测：使用迈瑞DC-N2S型彩色多普勒超声系统。患者空腹进行检查，取仰卧位，尽量外展右臂，取右侧腋前线至腋中线第7、8、9肋间隙作为检查区，注意避开大血管等主要结构组织；超声探头涂抹偶联剂，尽量保持超声探头垂直肋间皮肤，成功检查10次回波，取中位值作为检查结果，记录脾脏硬度值、肝脏硬度值、肝脏纤维化程度。整个操作不超过10 min。

miR-21检测：患者入院当天空腹时，以非抗凝管取肘静脉血2 mL，加Trizol试剂1 mL静置(27 ℃)5 min，离心9 min(半径8 cm，转速3500 r/min，2～8 ℃)后取上层血清，加0.2 mL氯仿，离心15 min(半径8 cm，转速3500 r/min，2～8 ℃)，取下层沉淀物，乙醇(75%)洗涤，弃上清液，干燥沉淀，紫外分光光度法测RNA完整性、纯度；用RT-PCR法逆转录RNA为cDNA后测定miR-21水平。操作均由专科资深医师规范完成。

1.3 观察指标

(1)对比两组患者脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平、肝脏纤维化程度。肝脏纤维化程度分级参考Ishak评分系统，0级为无纤维化；1级为有少数汇管区纤维化；2级为多数汇管区纤维化，无或有1条纤维间隔；3级为数汇管区纤维化，有2～3条纤维间隔；4级为汇管区纤维化伴显著汇管-汇管桥接纤维化，4条以上纤维间隔；5级为显著汇管-汇管桥接纤维化或汇管-中央桥接纤维化，1～3个假小叶；6级为假小叶超过3个。(2)分析脾脏和肝脏硬度值、血miR-21水平与HBC患者肝脏纤维化程度关系。(3)对比病例组不同预后患者脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平。(4)分析脾脏和肝脏硬度值、血miR-21单一预测HBC患者预后的价值。(5)分析脾脏和肝脏硬度值、血miR-21联合预测HBC患者预后的价值。(6)分析HBC患者预后死亡的影响因素。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组患者脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平、肝脏纤维化程度

病例组脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平、肝脏纤维化程度均高于对照组(P<0.05)，详见表2。

表2 两组病人脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平、肝脏纤维化程度对比

2.2 脾脏和肝脏硬度值、血miR-21水平与HBC患者肝脏纤维化程度关系

经Pearson相关性分析发现，脾脏硬度值、肝脏硬度值、血miR-21水平与HBC患者肝脏纤维化程度呈正相关(P<0.05)。详见图1。

图1 各指标与HBC患者肝脏纤维化程度关系a. 脾脏硬度值； b. 肝脏硬度值； c. 血miR-21水平

2.3 病例组不同预后患者的脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平

经6个月随访，无脱落病例。病例组死亡患者的脾脏和肝脏硬度值、血miR-21水平高于生存患者(P<0.05)，见表3。

表3 病例组不同预后患者的脾脏与肝脏硬度值、血miR-21水平对比

2.4 单一指标预测患者死亡的ROC曲线

图2为绘制的ROC曲线，显示脾脏和肝脏硬度值、血miR-21单一预测HBC患者预后死亡的AUC均较大，顺序为：血miR-21>肝脏硬度值>脾脏硬度值，详见表4。

图2 脾脏和肝脏硬度值、血miR-21单一预测HBC患者预后死亡的ROC曲线

表4 预测HBC患者预后死亡的ROC曲线值

2.5 联合预测患者死亡的曲线

应用脾脏和肝脏硬度值与血miR-21联合预测HBC患者预后死亡，绘制ROC曲线(图3)发现，联合预测时AUC为0.833，95%CI为0.712～0.955，预测敏感度为68.42%，特异度为97.26%。

图3 脾脏和肝脏硬度值与血miR-21联合预测HBC患者预后死亡的ROC曲线

2.6 Logistic回归分析

经Logistic回归分析可知，在控制了患者年龄、体质量指数、性别等基线资料后，脾脏和肝脏硬度值、血miR-21仍为HBC患者预后死亡的重要危险因素(P<0.05)，详见表5。

表5 HBC患者预后死亡影响因素的Logistic回归分析

3 讨论

HBC是肝组织细胞长期反复损害引起的一种弥散性、进行性纤维化病变过程，最终造成肝脏组织质地变硬，弹性变差，其病理改变常表现肝细胞弥散性变性坏死，出现纤维组织增生、肝细胞结节状再生等，如此反复会造成肝小叶结构、血液循环途径破坏，出现肝硬化。慢性乙型肝炎是诱发HBC的主要病因之一，其5年HBC发生率约8%～20%[7]。

HBC病程分为代偿期肝硬化和失代偿期肝硬化，前者生存期可达10年或更久，但后者常出现各种并发症，患者5年生存率自80%～85%降低至14%～35%[8]。因此，加强HBC及相关并发症的早期诊断，对抑制病情进展、延长生存期具有重要意义。

FibroScan是近年新兴的一种临床非侵入性肝脏疾病诊断技术，可准确反映肝组织硬度，主要应用于肝脏纤维化的诊断、评估及抗纤维化治疗的动态监测等，与常规肝组织穿刺活检对比，具有操作简单、客观性好、可重复性强等优势。FibroScan技术可通过剪切波传导，实施瞬时主动激励，同时辅助脂肪衰减模型推导肝脏信号衰减系数，定量反映上述肝硬化的病理改变[9,10]。学者董常峰等[11]分析了FibroScan对HBC患者肝脏/脾脏硬度检测值与门静脉高压间的关系，结果显示肝脏病变与肝脏/脾脏硬度值关系密切，随病变加重肝脏/脾脏硬度值、门静脉宽度均呈增加趋势。本研究发现，HBC患者脾脏与肝脏硬度值、肝脏纤维化程度均高于慢性乙型肝炎患者(P<0.05)，与上述研究结果相符。丁荣蓉等[12]检测284例慢性乙型肝炎患者的肝纤维化程度，发现脾脏与肝脏硬度值在评价肝脏纤维化程度方面价值较高，与肝组织病理学分期一致性良好。本文的相关性分析显示，脾脏、肝脏硬度值与HBC患者肝脏纤维化程度呈正相关(P<0.05)，提示脾脏、肝脏硬度值可为临床评价肝脏纤维化提供辅助参考。

为进一步提高诊断效能，近年国内外学者建立了多个HBC诊断的无创血液学模型，研究显示HBC患者肝组织细胞内存在多种microRNA异常表达，其中miR-21在炎症刺激诱导的纤维化进程中发挥关键调控作用[13,14]。本研究显示，病例组患者血miR-21水平高于对照组，且与肝脏纤维化程度呈正相关(P<0.05)，符合上述报道中miR-21参与调控肝纤维化进程的病理生理机制。牛连杰和龙翔宇等[15,16]的研究指出，在肝癌组织癌细胞内miR-21较正常肝细胞表达上调，可通过抑制人第10号染色体缺失磷酸酶表达介导肝细胞恶变，推测miR-21异常表达可能在HBC失代偿期继发肝癌过程中起关键作用。此外，外周血miR-21主要来源于器官组织细胞凋亡和释放，而HBC随病情进展，病毒载量升高及炎症反应增强，持续导致肝实质细胞变性并释放miR-21入血[17,18]，也会导致血miR-21增高。

随访6个月发现，病例组死亡患者入院时的脾脏及肝脏硬度值、血miR-21水平均高于生存患者(P<0.05)，提示脾脏和肝脏硬度值、血miR-21在HBC病情进展过程中具有相似变化趋势。ROC曲线分析显示，脾脏和肝脏硬度值与血miR-21联合预测HBC患者预后死亡的AUC值为0.833，敏感度和特异度均高于任一单独检测，说明脾脏和肝脏硬度值、血miR-21与HBC患者预后密切相关。此外，有研究显示，HBC患者病情进展、生存期受性别、年龄、体质量等多种因素影响[19,20]。本研究中用Logistic模型控制上述变量后仍发现脾脏、肝脏硬度值、血清miR-21为HBC患者预后死亡的重要危险因素(P<0.05)，因此，可认为三者联合具有良好的预后评估价值。但本研究不足之处在于未探明miR-21与脾脏、肝脏硬度值间是否存在共性关系，其协同介导HBC病情进展过程还需后期进一步实验探究。

综上可知，FibroScan参数及血miR-21水平变化与肝脏纤维化程度关系密切，是HBC患者预后死亡的独立危险因素，联合检测可从宏观及微观层面为临床评价预后提供参考。