高效液相色谱法在抗生素类药物残留中的应用

李香霖

新疆伊犁川宁生物技术有限公司 新疆伊宁 835800

现临床上抗生素常作为预防用药及治疗用药使用，起到抑菌或杀菌作用，但滥用抗生素会导致体内菌群紊乱、免疫系统遭到破坏、细菌的耐药性增强，甚至出现内脏损伤、严重感染等不良反应[1]。本研究在对《规范》中测定6种抗生素和甲硝唑的HPLC方法流动相系统等方面进行了合并优化，采用甲醇和0.1mol/L盐酸（体积比1：1）提取样品，使用乙腈-甲酸梯度洗脱系统，在C18色谱柱上对祛痘类化妆品中6种抗生素和甲硝唑进行分离检测，并进行方法学验证。所建立的方法简便可行，科学准确；经173批次样品检测证明，此方法具有较强的适用性和耐用性。

1 高效液相色谱法简介

HPLC本身是色谱法诸多技术之一，也是代表性的技术。HPLC也是药品检验中的关键方法。主要的运作，就是以高压输液泵为主要的运行设备，将诸多成分比例不同的混合溶液或者单溶液，形成的流动相，借助设备将其压进固定相的专有色谱柱，注入到样品里，从而借助流动相就会流入到色谱柱里，在色谱柱里，各种成本就会得到充分地分离，然后逐渐进入到检测设备中。对成本展开检测，对样品展开全方位的化学分析。HPLC最开始在药品检验中发挥出作用，可以追溯到二十世纪的七十年代，因此从现阶段HPLC的应用水平上看，还是积累了非常丰富的使用实践经验，可以在应对各种工作状况时采取丰富的经验措施。HPLC相比于传统的色谱检验方法来看，可以实现更加固定地药品检验，在检验过程中，能够更好地实现对检测物细化。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

岛津LC-20A高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器，日本岛津公司；电子天平BSA224S-CW型与BT125D型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；涡旋混合器，东京理化器械株式会社；高速离心机MultifugeX1R，ThermoFisherScientific；超纯水机，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-500DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。盐酸美满霉素（批号1-QL-98-1，w=97%）、二水土霉素（批号19-ANR-82-1，w=98%），TRC；甲硝唑（批号100191-201507，w=100%）、盐酸四环素（批号130488-201604，w=98.4%）、盐酸金霉素（批号130489-201403，w=94.1%）、盐酸多西环素（批号130485-201202，w=85.2%）、氯霉素（批号130555-201203，w=99.8%），中国食品药品检定研究院；甲醇，色谱纯，德国Merck公司；磷酸，分析纯，天津市百世化工有限公司。

2.2 色谱条件

色 谱 柱：PhenomenonLunaC18(4.6mm×250mm×5μm)；流动相：A相为乙腈，B相为质量分数0.1%甲酸，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；进样量10μL；检测波长268nm；柱温30℃；流速1min/mL。

2.3 标准溶液的配制

分别准确称取上述6种抗生素和甲硝唑标准物质约10mg于棕色容量瓶中，加入适量的0.1mol/L盐酸溶液溶解后，用甲醇溶解并定容，得各抗生素单标储备液；精密移取各标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，配制成混合标准溶液；用甲醇逐级稀释配制成系列混合标准溶液。

3 结果与讨论

3.1 流动相选择

按照《规范》中检测盐酸美满霉素等7种组分的方法，采用草酸+甲醇+乙腈作为流动相进行检测，图1列出了空白溶剂色谱图。从中可以发现，在保留时间3min处，出现较高的溶剂峰：正峰和负峰；因草酸中含有C=O键，在紫外光波长210nm处有吸收。同等条件下测定盐酸美满霉素等7种组分的色谱图，在相应保留时间处溶剂正峰与盐酸美满霉素峰部分重叠；虽然调整流动相比例可将溶剂峰与盐酸美满霉素峰稍分开，但分离度未达到1.0，在样品测定中易产生假阳性判定。

3.2 色谱柱选择

采用本研究中的系统条件，考察不同色谱柱对6种抗生素及甲硝唑的分离情况在3种不同色谱柱上盐酸美满霉素等7种组分均分离度良好。其中，盐酸美满霉素等7种组分保留时间稍有变化，但出峰顺序一致，分离度良好；在色谱柱色谱图中盐酸美满霉素和甲硝唑出峰顺序不同，分离度良好；此方法较稳定，重现性好，可用于盐酸美满霉素等7种组分的检验检测[2-3]。

3.3 回收率与精密度

选择不含6种抗生素和甲硝唑的水、乳、膏、霜四种不同基质化妆品各一种，每种取9份，分别加入低（60%）、中（100%）、高（140%）三个梯度的对照品，每个浓度梯度样品做3份平行样，作为加标回收样，依本研究建立的方法进行样品处理和测定，计算回收率及相对标准偏差（RSD）。不同基质中各组分的加样回收率范围为96.5%～110.8%，RSD范围为0.32%～1.85%，表明方法准确性良好，所选择的提取方法能较为完全地提取水、乳、膏和霜四种基质化妆品中的目标组分。