生物技术在食品检测中的应用研究

2020-11-26王蕊

商品与质量 2020年44期

王蕊

昆明市食品药品检验所（昆明市食品药品检验研究院）云南昆明 650000

食品安全问题引起了人们的高度关注，与人们的健康息息相关。因此，做好食品检测问题非常必要。近年来，杂交探针技术与聚合酶链反应技术在食品检测中得到广泛应用。

1 杂交探针在食品检测中的应用

在分子生物学中，杂交探针是可变长度的DNA或RNA片段（通常长100-10000个碱基），可以进行放射性标记或荧光标记。然后可以将其用于DNA或RNA样品中，以检测与探针序列互补的核苷酸物质（RNA靶标）的存在[1]。因此，在食品检测中，探针与单链核酸（DNA或RNA）杂交，由于探针和靶标之间的互补性，其碱基序列允许探针与靶标碱基配对。首先将标记的探针变性（通过加热或在碱性条件下，例如暴露于氢氧化钠中）制成单链DNA（ssDNA），然后与固定在膜或膜上的靶标ssDNA（Southern blotting）或RNA（northern blotting）杂交。为了检测探针与其靶序列的杂交，用放射性或荧光分子的分子标记物标记探针。常用的标记是32P，掺入探针DNA磷酸二酯键的磷的放射性同位素，或洋地黄毒苷，后者是基于抗体的非放射性标记，然后通过放射自显影或其他成像技术将杂交的探针可视化，即可检测到与探针具有中等至高度序列相似性的DNA序列或RNA转录本。通常，在食品检测中，该方法是从滤光镜上拍摄X射线照片，或者将滤光镜置于紫外线下，具有中等或高度相似性的序列的检测取决于施加杂交条件的严格程度，高杂交温度和杂交缓冲液中的低盐分仅允许高度相似的核酸序列之间的杂交，而低严格性因为具有较低的温度和较高的盐分，当序列不太相似时允许杂交。基于分子DNA或RNA的探针通常用于筛选基因库，使用印迹法检测核苷酸序列以及用于其他基因技术，例如核酸和组织微阵列，可提升食品检测的效率。

2 聚合酶链反应在食品检测中的应用

聚合酶链反应（PCR）是一种广泛用于快速制造特定DNA样品的数百万至数十亿个拷贝的方法。在食品检测中，使用PCR，可在一系列温度变化循环中以指数方式扩增非常少量的DNA序列副本。

在食品检测中，大多数PCR方法依赖于热循环，热循环使反应物经受重复的加热和冷却循环，以允许进行不同的温度依赖性反应，特别是DNA熔解和酶驱动的DNA复制。PCR使用两种主要试剂-引物（一种短的单链DNA片段，称为寡核苷酸，是与目标DNA区域的互补序列）和一种DNA聚合酶。在食品检测第一步中，DNA双螺旋的两条链在称为核酸变性的过程中在高温下物理分离。在第二步中，降低温度并且引物与DNA的互补序列结合。然后，两条DNA链成为DNA聚合酶的模板，以酶从游离核苷酸（DNA的组成部分）中酶促组装一条新的DNA链。随着PCR的进行，生成的DNA本身将用作复制模板，从而启动链式反应，在该反应中原始DNA模板被指数扩增。

在食品检测中，PCR由一系列20-40次重复的温度变化（称为热循环）组成，每个循环通常由两个或三个离散的温度步骤组成。在循环之前，通常先在非常高的温度（＞90°C）下执行一个温度步骤，然后在最后一站进行最终产品扩展或短暂存储。在每个循环中使用的温度及其施加的时间长短取决于多种参数，包括用于DNA合成的酶，反应中二价离子和dNTPs的浓度以及引物的解链温度（Tm）。食品检测要经过以下几个步骤：

初始化：只有需要通过热启动PCR进行热激活的DNA聚合酶才需要执行此步骤，其包括将反应室加热到94-96°C的温度，如果使用极热稳定的聚合酶，则加热到98°C，然后保持1-10分钟。

变性：这是第一个常规循环事件，包括将反应室加热到94-98°C20-30秒，这会通过破坏互补碱基之间的氢键，导致双链DNA模板的DNA熔化或变性，从而产生两个单链DNA分子。

退火：在下一步中，将反应温度降低至50-65°C持续20-40秒，从而允许将引物退火至每个单链DNA模板。反应混合物中通常包含两种不同的引物，一种用于含有靶标区域的两种单链互补链。引物本身是单链序列，但比靶区域的长度短得多，仅在每条链的3'端仅互补非常短的序列。

确定退火步骤的合适温度至关重要，因为效率和特异性会受到退火温度的强烈影响。该温度必须足够低以允许引物与链杂交，但是必须足够高以使杂交是特异性的，即引物应仅与链的完全互补部分结合，而无其他结合。如果温度太低，则底漆可能会结合不良。如果太高，引物可能根本不结合。典型的退火温度比所用引物的Tm低约3-5°C。只有当引物序列与模板序列非常匹配时，互补碱基之间才会形成稳定的氢键。在此步骤中，聚合酶与引物-模板杂交体结合并开始DNA形成。此步骤的温度取决于所用的DNA聚合酶。Taq聚合酶的热稳定DNA聚合酶的最佳活性温度约为75-80°C，尽管通常使用72°C的温度酶。在此步骤中，DNA聚合酶通过从反应混合物中添加与模板互补的方向的游离dNTP，从而合成与DNA模板链互补的新DNA链，从而使5'-磷酸基团缩合。在新生（伸长）DNA链末端带有3'-羟基的dNTP。延伸所需的精确时间取决于所用的DNA聚合酶和要扩增的DNA靶区域的长度。根据经验，在食品检测中，大多数DNA聚合酶在最佳温度下每分钟聚合一千个碱基。在最佳条件下，由于底物或试剂的限制没有限制，在每个食品检测步骤中，DNA靶序列的数量都会加倍。在每个连续的周期中，原始模板链加上所有新生成的链成为下一轮延伸的模板链，从而导致特定DNA靶区域的指数扩增，从而改善食品检测的效果[2]。