多肉植物红心莲茎腐病尖孢镰刀菌LAMP快速检测技术的建立

姚锦爱，黄 鹏，陈汉鑫，侯翔宇，余德亿

（1.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/福建省农业科学院植物保护研究所，福建 福州 350013；2.漳州市农业科学研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意义】多肉植物红心莲（EcheveriaPerle von Nürnberg）又名紫珍珠，其根、茎、叶肥厚多汁，可储藏大量水分，是景天科（Crassulaceae）石莲花属(Echeveria)的重要商业化品种[1]。近年来，在福建漳州多肉植物种植基地发现红心莲植株出现叶片黄化、红紫、脱落等病症，经调查发现其茎部有褐色病斑，维管束和髓部变色；严重时，茎基部腐烂缩缢，植株倒伏死亡，对多肉植物产业造成威胁。经对发病部位切片镜检发现该病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的红心莲茎腐病。尖孢镰刀菌是重要的植物土传病原真菌，潜伏期长，侵染初期在植株外观上通常不显症，待表现症状后再采取防控措施，为时已晚[2-3]。为有效防控尖孢镰刀菌引起的红心莲茎腐病为害，生产上迫切需要建立一种快速、准确检测红心莲等景天科多肉植物尖孢镰刀菌的方法。

【前人研究进展】环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）是一种简便、快速、精确、经济的检测方法，其检测时间与常规PCR 法相比大大缩短（通常1 h 内）且特异性更高[4-6]，此外LAMP 法还可通过添加SYBR Green I、calcein、溴酚蓝等DNA 染料，实现检测结果的直观可视化[7]。目前该检测技术已成功应用于炭疽菌属Colletotrichumspp.、镰刀菌属Fusariumspp.、疫霉菌属Phytophthoraspp.等植物病原真菌的快速检测[8-10]。其中镰刀菌属LAMP 检测涉及的寄主植物包括大豆、黄瓜、水稻、鹰嘴豆、玉米、小麦等[10-15]。【本研究切入点】但未见LAMP 应用于多肉植物镰刀菌属病原菌检测的相关报道。【拟解决的关键问题】为了获得特异性和灵敏度更高的适用于红心莲尖孢镰刀菌LAMP 检测的特异性引物，选取在镰刀菌种的水平上信息丰富保守基因EF-1a（Elongation factor 1α）为靶点，对红心莲尖孢镰刀菌EF-1a基因和其他镰刀菌序列进行差异性分析，选取6 个特定区域，设计了4 条特异性的LAMP 引物，建立一种LAMP可视化检测方法，以期在多肉植物红心莲茎腐病发生初期实现病原菌的快速准确检测，为该病害的早期防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料及DNA 提取

供试菌株见表1，包括17 株镰刀菌属病原菌（其中10 株为尖孢镰刀菌）和10 株其他菌属病原菌（其中3 株寄主为多肉植物）。病原菌在装有100 mL马铃薯-葡萄糖肉汤（每升蒸馏水中含200 g 马铃薯，20 g 葡萄糖）的250 mL 三角烧瓶中培养，在26 °C恒温摇床150 r·min-1培养5～6 d；真空过滤收集各菌株菌丝，后冻干48 h，用DNA 提取试剂盒（天根生物技术有限公司）提取各菌株基因组DNA，DNA 浓度使用NanoDrop 2000C 分光光度计测定（Thermo Fischer Scientific, USA），DNA 作为LAMP 检测的模板用无菌双蒸馏水按要求稀释。

1.2 引物设计及合成

比对红心莲尖孢镰刀菌和GenBank 中的其他7 株镰刀菌属病原菌的EF-1a基因序列，利用在线LAMP 引物设计软件Primer software Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan）设计一套红心莲尖孢镰刀菌特异性LAMP引物组，包括1 对外侧引物F3/B3 和1 对内侧引物FIP/BIP 组 成（图1）；利 用 软 件primer 5 设 计1 对PCR 引物。LAMP 及PCR 引物序列见表2，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 LAMP 反应体系优化

参考李华伟等[7]的方法建立红心莲茎腐病菌LAMP（25 μL）反应体系。LAMP 反应温度及时间优化：将底物、引物、红心莲尖孢镰刀菌样本DNA 依次加入PCR 管混匀，无菌双蒸水补至25 μL，分成2 组；1 组用于最佳温度梯度试验，反应设60、61、62、63、64、65、66 ℃等7 个温度梯度，反应时间为60 min；另1 组取前1 组中最佳反应温度，后设30、45、60、75、90 min 等5 个时间梯度；2 组试验反应最后分别于80 ℃加热10.0 min，最后在冰上终止反应；设3 次重复。LAMP 扩增结果的判定：反应前在PCR 管盖内侧加入2 μL 的1 000×SYBR Green Ⅰ，反应后瞬时离心将1 000×SYBR GreenⅠ离心至管底与LAMP 反应产物混匀，观察LAMP反应产物颜色判定扩增结果。LAMP 检测结果可靠性验证：以红心莲尖孢镰刀菌DNA 为阳性对照、无菌双蒸水为阴性对照，采用建立的红心莲尖孢镰刀菌LAMP（25 μL）反应体系及琼脂糖凝胶电泳法进行验证。

1.4 LAMP 特异性检测及灵敏度验证

特异性验证：对27 株供试菌株进行LAMP 检测，通过观察LAMP 产物颜色判定扩增结果；后从反应菌株中挑选1 株从红心莲上分离的F.oxysporum，3 株从多肉植物上分离的Colletotrichum destructivum、Corynespora cassiicola和Alternaria alternata，3 株 从其他寄主植物上分离的镰刀菌属菌株F.moniliforme、F.solani和F.sporotrichioides，共7 株菌株进行琼脂糖凝胶电泳，以无菌双蒸水为阴性对照，通过判定电泳梯形条带的有无验证LAMP 检测的特异性。试验设3 次重复。

表1 用于LAMP 试验的菌株Table 1 Fungal isolates tested by LAMP assay

图1 红心莲尖孢镰刀菌LAMP 引物设计Fig.1 Design of LAMP primers for F.oxysporum in Echeveria

灵敏度验证：将红心莲尖孢镰刀菌样本DNA按10 倍 浓 度 梯度依次稀释为10 ng·μL-1～1 fg·μL-18 个不同浓度，同时进行LAMP 检测和PCR 检测，比对2 种检测方法的灵敏度差异；试验设3 次重复。

表2 红心莲尖孢镰刀菌LAMP 及PCR 检测引物Table 2 LAMP and PCR primers of F.oxysporum in Echeveria

1.5 田间发病样品的LAMP 检测

利用建立的LAMP 检测方法对采自福建（10 份样本）及云南（5 份样本）自然感染的红心莲茎腐病发病样本进行检测，同时通过PCR 方法和组织分离法进行检测验证。LAMP 和PCR 检测样本DNA 参照Lan 等[12]的方法提取；组织分离法参照Yao 等[3]的方法进行，略加改动。

2 结果与分析

2.1 LAMP 检测方法建立

LAMP 反应温度及时间优化结果显示，在7 个温度梯度中，当反应温度62 ℃时，有梯形条带出现，但条带弱，随着反应温度提高，条带变亮，当反应温度达65 、66 ℃时，条带扩增效果较好且无明显差异（图2-a），确定最佳反应温度为65 ℃。在5 个时间梯度中，反应时间45 min 时，出现梯形条带，但条带弱，随着反应时间延长，条带变亮，在60、75、90 min 时扩增效果好，但效果差异不明显（图2-b），为提高LAMP 检测效率，确定最佳反应时间为60 min。依此建立红心莲尖孢镰刀菌LAMP（25 μL）最优反应体系：底物为20 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1（NH4）2SO4、 6.0 mmol·L-1MgSO4、50 mmol·L-1KCl、0.8 mmol·L-1甜菜碱、1.4 mmol·L-1dNTPs 和8 UBstDNA 聚 合 酶，引 物 为0.2 μmol·L-1外 侧 引 物F3/B3 和1.6 μmol·L-1内 侧 引 物FIP/BIP，1 μL 样本DNA（50 ng），无菌双蒸水补足25 μL；LAMP 反应温度及时间分别为65 ℃和60 min；后置于80 ℃加热10.0 min，最后在冰上终止反应。反应前在PCR 管盖内侧加入2 μL 的1 000×SYBR Green Ⅰ，反应后瞬时离心，观察产物颜色，阳性呈绿色，阴性呈黄绿色。

图2 LAMP 反应最佳温度及时间筛选Fig.2 Optimal reaction temperature and time for LAMP assay

LAMP 检测结果可靠性验证表明，阳性对照呈绿色，对应的琼脂糖凝胶电泳扩增出梯形条带；阴性对照呈现黄绿色，琼脂糖凝胶电泳无梯形条带（图3）。表明建立的LAMP 检测方法可行，能可靠检测到红心莲尖孢镰刀菌F.oxysporum。

图3 LAMP 检测红心莲尖孢镰刀菌Fusarium oxysporumFig.3 Detection of F.oxysporum on Echeveria by LAMP assay

2.2 LAMP 特异性检测及灵敏度验证

特异性检测结果显示，27 株供试菌株（表1）中仅有尖孢镰刀菌菌株的LAMP 反应管呈阳性反应，其他菌株LAMP 反应管均呈阴性反应；进行琼脂糖凝胶电泳的7 株菌株，仅红心莲尖孢镰刀菌产生电脉梯形条带，其他6 株菌株和阴性对照均没有产生条带（图4）。说明本研究建立的LAMP检测方法具特异性，仅能检出红心莲尖孢镰刀菌F.oxysporum。

灵敏度验证结果显示，当红心莲尖孢镰刀菌F.oxysporum样 本DNA 质 量 浓 度 为10 fg·μL-1时，LAMP 产物呈绿色（图5），发生阳性反应，对应的琼脂糖凝胶电泳扩增出梯形条带（图5）；而PCR检测在DNA 质量浓度为100 fg·μL-1时条带开始变弱，DNA 质量浓度为10 fg·μL-1时已观察不到条带（图5）。说明本研究建立的LAMP 检测方法具更高的灵敏性，其灵敏度是PCR 检测的10 倍。

图4 LAMP 检测特异性验证Fig.4 Specificity of LAMP assay

图5 LAMP 灵敏度检测验证Fig.5 Sensitivity of LAMP and PCR

2.3 田间发病样品的LAMP 检测

选取15 份自然感染茎腐病菌红心莲茎腐病茎部组织样本，其中8 份茎部有明显褐色病斑；5 份症状不明显，茎部有零星褐色小点；2 份无发病症状。经LAMP 检测、PCR 检测和组织分离法分别检测结果表明，田间红心莲茎腐病原菌-尖孢镰刀菌的检出率均为100%，3 种方法的检测符合率100%，说明本研究建立的LAMP 检测法可用于由尖孢镰刀菌引起红心莲茎腐病的田间快速检测。

3 讨论与结论

LAMP 检测技术是新兴的基因扩增技术，被广泛用于植物病原菌的快速检测，与PCR 检测相比，其可在更短时间内简便地扩增到靶标病原菌[16]。本研究根据红心莲尖孢镰刀菌的靶标基因序列EF-1α的6～8 区 域 设 计 特 异 性LAMP 引 物 组，通 过LAMP 体系优化，建立了红心莲尖孢镰刀菌LAMP快速检测方法，其对红心莲茎腐病发病样本的检测结果与PCR 及组织分离法检测的结果一致，可用于由尖孢镰刀菌引起红心莲茎腐病的田间快速检测。

特异性是LAMP 检测技术的一个重要指标，国内外学者在尖孢镰刀菌及相关种的LAMP 检测中利用不同靶标基因序列设计特异性引物[12,17-18]，并根据这些特异性引物建立相应的LAMP 检测体系。EF-1a基因序列信息丰富，有研究表明EF-1a基因在镰刀菌种间具有一定的保守性，与rDNA-ITS、RAPD、β-tubulin 等基因相比更具特异性[19]，此外Ghosh 等[14]报道了以EF-1a基因为靶标设计LAMP 引物检测F.oxysporumf.sp.Ciceris，说明EF-1a基因序列适用于尖孢镰刀菌LAMP 引物的设计。本研究选择红心莲尖孢镰刀菌EF-1α作为靶标基因序列设计LAMP 特异性引物有效扩增到了所有的尖孢镰刀菌分离株，未能扩增所有其他菌株，包括一些密切相关的多肉植物上分离的Colletotrichum destructivum、Corynespora cassiicola、Alternaria alternata， 以 及F.sporotrichioides、F.moniliforme、F.sambucinum、F.solani、F.nivale、F.acuminatum和F.avenaceum等镰刀菌属真菌，表现出很高的特异性。

灵敏度是LAMP 检测技术的另一个重要指标，众多研究表明LAMP 检测灵敏度一般高于相应的PCR检测[4,18,20]。本研究建立的LAMP 方法DNA 检测最小质量浓度为10 fg·μL-1，而PCR 检测为100 fg·μL-1，LAMP 法检测灵敏度提高了10 倍；其灵敏度均高于以其他基因为靶点建立的LAMP 方法[17-18]。Ghosh 等[14]报道了以EF-1a基因为靶点设计LAMP 引物检测F.oxysporumf.sp.ciceris，其灵敏度与本研究设计的特异性引物一致。但随着灵敏度的提高，易导致开盖形成气溶胶污染，造成假阳性；本研究以SYBR GreenⅠ作显色剂，反应前直接滴于PCR 管盖内侧，降低了假阳性出现。

本研究建立的红心莲尖孢镰刀菌LAMP 快速检测技术体系，不仅特异性强、灵敏度高，而且检测结果可视、假阳性低，在田间能快速检测出由尖孢镰刀菌引起的红心莲茎腐病，具有很好的应用推广前景。今后，可对各种尖孢镰刀菌专化型的靶标基因序列进行探究，建立更加特异、灵敏的尖孢镰刀菌专化型LAMP 快速检测技术体系。