新型冠状病毒关键受体ACE2基因启动子的生物信息学分析

王 道，刘 丹

(中南大学湘雅二医院妇产科，中国 长沙 410011)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β-冠状病毒[1,2]，2019年12月底在湖北省武汉市华南海鲜市场爆发。截至2020年8月11日，已经造成全国89 383人感染，超过4 000人死亡；世界卫生组织(WHO)报道海外累计确诊20 231 007例，累计死亡735 117人。SARS-CoV-2是继SARS-CoV和MERS-CoV后，引起人类严重呼吸系统疾病和死亡的高致病冠状病毒[3]。SARS-CoV-2基因组是由约30 kb核苷酸组成的单链RNA。经过研究机构早期基因测序，发现其与中华菊头蝠的冠状病毒序列高度相似，推测蝙蝠是SARS-CoV-2的最初天然宿主[4]。SARS-CoV-2主要编码4种结构蛋白：刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)[5]。SARS-CoV-2刺突蛋白(S)的受体结合域(RBD)与宿主受体血管紧张转换酶2(ACE2)相互作用，促进新型冠状病毒的跨物种和人与人之间的传播[6]。

以往证据[7]表明，ACE2不但是SARS-CoV-2的重要受体，而且在心血管系统中起保护作用。ACE2 是肾素-血管紧张素系统的调节剂，能催化血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)转化为血管紧张素1～7 (Angiotensin 1～7)。而且，ACE2在心脏、肾脏、睾丸、结肠、肺以及中枢神经系统等人体器官广泛表达[8,9]，特别是在非免疫细胞上，如呼吸道、肠上皮细胞、内皮细胞、肾细胞和肺泡单核细胞等[10,11]。在人体呼吸系统中，研究者发现，ACE，AngⅡ和AT1R是促进肺损伤的因子，但是ACE2却能保护肺部免受损伤[7]。近期有学者称，SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2的亲和力比SARS-CoV高10至20倍[12]，暗示这种亲和力的增加使得COVID-19更容易在人群之间传播。因此，ACE2有可能成为预防COVID-19的潜在靶标。

SARS-CoV-2比SARS-CoV更加“狡猾”，易于突变和重组。冠状病毒的变异可能会使某些亚型更容易与受体ACE2结合，从而给各国疫苗研发带来新的挑战。目前，对人ACE2基因的启动子仍然缺乏报道和系统研究，没有针对性的抗病毒策略。所以，本文重点利用生物信息学数据库，预测人ACE2基因核心启动子区，对CpG岛、转录因子结合位点以及SNP位点进行系统分析，这不仅可加快对人类ACE2基因特性和SARS-CoV-2发病机制的研究进程，也可为预防COVID-19和药物治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 人类ACE2基因的序列信息来源

本研究从GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.gov/genbank)中查找人ACE2基因序列信息(Gene ID: 59272)，mRNA登录号：NM_001371415。

1.2 重要的生物信息学数据库网站

本研究对人ACE2基因启动子进行预测和分析，运用的重要生物信息数据库网站如表1所示。

表1 生物信息学数据库及网址

1.3 方法

1.3.1 人ACE2基因序列的获取 从GeneBank数据库中检索“ACE2”, 获得人类ACE2基因ID为59272，下载FASTA格式获得基因制表符文件。

1.3.2 人ACE2基因启动子区域序列的获取 从UCSC网站中查找人类ACE2基因，推导出基因组序列(Ch38.p13)及转录起始位点的准确位置。以转录起始点(TSS)为界限，截取基因组序列上游2 000 bp 至下游100 bp共2 100 bp的序列，预测其序列信息中包含ACE2基因可能的启动子序列。

1.3.3 人ACE2基因启动子序列的分析 运用启动子分析软件Promoter 2.0 Prediction Server，对其启动子进行预测。使用Neural Network Promoter Prediction软件时，对 >0.85序列进行分析。

1.3.4 人ACE2基因转录因子结合位点的分析 登录Gene-Regulatiion网站，选择AliBaba 2.1程序，输入ACE2基因启动子区域2 100 bp的DNA序列，联机TRANSFAC 4. 0数据库，得到转录因子与ACE2基因的潜在结合位点。

登录PROMO网站，对人ACE2基因5′调控区转录因子结合位点进行预测，设置参数：Considering factors选择Only human factors；Considering sites选择Only human sites；其它参数选择默认值。

登录JASPAR网站对人ACE2基因5′调控区转录因子结合位点进行预测，设置参数：JASPAR matrix model species选择Homo sapiens；Number of matrices选择200；Type选择Within each matrix；Relative profile score threshold选择80%，85%，90%及95%。

1.3.5 人ACE2基因启动子CpG岛分析 输入人ACE2基因上游至5′侧翼2 100 bp的序列，对CpG岛可能存在位置进行预测。使用EMBOSS，MethPrimer和CpG Finder预测人ACE2基因5′上游2 100 bp序列中甲基化CpG岛。

1.3.6 人ACE2启动子区SNP筛选及其潜在功能预测 利用SNP功能分析软件SNP Function Prediction对人ACE2基因启动子单核苷酸多态性 (SNP)位点进行预测。

2 结果与分析

2.1 人ACE2基因特征以及染色体定位

ACE2基因GeneBank的登录号为NC _000023.11，定位于X号染色体p22.2 (图1)。基因总长107 638 bp(15 494 520～15 602 158 bp)，转录产物NM_001371415379.1，编码蛋白质产物ID为NP_001358344.1。人ACE2基因包含18个外显子和17个内含子，蛋白产物由805个氨基酸组成。

图1 人ACE2基因染色体定位图谱Fig. 1 Chromosomal localization of human ACE2 gene

2.2 人ACE2基因的启动子预测

Promoter 2.0 Prediction Server和Neural Network Promoter Prediction预测的结果如表2和表3所示。Promoter 2.0预测的结果提示，ACE2基因上游可能存在1个启动子区，其中临界预测位于800 bp处。Neural Network Promoter Prediction软件预测的结果提示，ACE2基因上游可能存在2个不同的启动子序列，其中第一个序列位于1 417～1 467 bp处，Score值为0.88；第二个序列位于1 964～2 014 bp处，Score值为0.96。

表2 Promoter 2.0 Prediction Server 预测人ACE2基因的启动子

表3 Neural Network Promoter Prediction Server预测人ACE2基因的启动子

运用GeneCopoecia网站对人ACE2基因启动子克隆搜索，产品编号为HPRM50128。HPRM50128全长1 582 bp，TSS位于产品1 282 bp 的G碱基处。将HPRM50128的序列和人ACE2基因5′调控区2 100 bp序列用Blast进行序列比对。结果显示5′调控区2 100 bp序列的809～2 100 bp与HPRM50128的1～1 292 bp完全相同，5′调控区2 100 bp序列的2 090 bp的G碱基与HPRM50128的1 282 bp 的G碱基对应。由此，笔者推测人ACE2基因的核心启动子区域应位于5′调控区2 100 bp序列内。

2.3 人ACE2基因5′调控区转录因子结合位点分析

AliBaba 2.1联合TRANSFAC数据库后，共获得203个转录因子结合位点，主要包括HNF-3，GCN4，Oct-1，TEC1，GR，HNF-1，GATA-1，C/EBPa1p，Hb，Ftz，Sp1，c-Ets-1，E4，GAT，A-1，TBP，NF-1，Egr-1，USF，RXR-beta，COUP，D1，NF-kappaB，NRL，HN，F-1，YY1，NF-muE1，E1，MyoD，REB1，C/EBPde1，Eve，REV-ErbA等(图2)；PROMO对人ACE2基因5′调控区的转录因子结合位点进行预测，共获得70个转录因子结合部位(图3)；被2种软件共同预测到的结合位点位置相同的转录因子有24种。

图2 AliBaba 2.1对人ACE2基因启动子区域转录结合位点分析的部分结果Fig. 2 Analysis part results of transcription factor binding sites in the promoter region of human ACE2 gene predicted by AliBaba 2.1

图3 PROMO对人ACE2基因启动子区域转录结合位点分析的结果Fig. 3 Analysis results of transcription factor bindin sites in the promoter region of human ACE2 gene predicted by PROMO

运用JASPAR对人ACE2基因5′调控区的转录因子结合位点进行预测，Relative profile score threshold选择80%，85%，90%及95%，获得正负链上转录因子结合位点数依次为137，66，46及20个，其中Relative profile score threshold选择95%转录因子结合位点预测结果见表4。选择转录因子“EOMES”，当设置Relative profile score threshold为95%时，获取7个潜在的转录因子结合位点(表5)。

表4 JASPAR 软件预测人ACE2基因 5′调控区转录因子结合位点的结果

表5 人ACE2基因5′调控区序列上EOMES转录因子结合位点的预测结果

2.4 人ACE2基因启动子区域甲基化CpG岛预测

EMBOSS预测结果显示存在1个CpG岛，其长度是277 bp，位于预测序列282～558 bp处(图4)。MethPrimer预测结果显示1个CpG岛位于282～558 bp处，长度为277 bp(图5)。CpG Finder预测的CpG岛位于290～564 bp，大小为275 bp(图6)，与EMBOSS和MethPrimer预测结果高度一致。

图4 人ACE2基因启动子区甲基化CpG岛EMBOSS软件预测图谱Fig. 4 Methylated CpG island map of human ACE2 gene predicted by EMBOSS

图5 人ACE2基因启动子区甲基化CpG岛MethPrimer 预测图谱Fig. 5 Methylated CpG island map of human ACE2 gene predicted by MethPrimer

图6 人ACE2基因启动子区甲基化CpG岛CpG Finder预测图谱Fig. 6 Methylated CpG island map of human ACE2 gene predicted by CpG Finder

2.5 人ACE2基因启动子区SNP预测和分析

运用SNP Function Prediction进行功能预测和种族特异性等位基因频率查询。结果显示， rs12012790，rs4830977，rs4830978，rs4830979，rs5934263，rs5936010和rs997294的保守性极低，在4种人群中rs4830977，rs4830978及rs997294存在种族差别，中国汉族人(CHB)和日本东京人(JPT)的等位基因频率基本相同(表6)。利用此软件进一步筛选出rs4830978，rs5934263和rs5936010存在非同义SNP(nsSNP)，其等位基因Allele和临床意义RegPotential得分等信息见表7。

表6 人ACE2基因启动子区SNP功能信息和种族特异等位基因频率预测

3 讨论

众所周知，了解SARS-CoV-2感染过程对研发SARS-CoV-2的药物和疫苗至关重要。Donoghue等[13]研究发现ACE2是羧肽酶(ACE)的同源物，在大多数组织中都有活性。早期研究表明[14]，肾素-血管紧张素系统(RAS)参与了SARS的发病过程，ACE2起到羧肽酶的作用，与RAS等其他成分一起在调节急性肺衰竭的严重程度方面起着核心作用。研究者们还发现COVID-19的流行大爆发与ACE2基因编码SARS-CoV-2和SARS-CoV感染人类宿主细胞的受体有密切关系[15]。但与其它冠状病毒感染后引起的普通感冒症状相比，SARS-CoV-2感染可导致致命肺炎。Cheng等[7]证实了ACE2在急性肺损伤中的保护作用，可调节ACE2/Ang 1～7从而减轻冠状病毒造成的组织损伤。而Hoffmann等[16]和Walls等[17]表明ACE2可促进病毒进入肺上皮表面，这些发现都提示在SARS-CoV-2感染致病过程中应该关注ACE2的双重作用。

人类ACE2基因是定位在染色体Xp22.2，全长约107 638 bp，具有单一胞外催化结构域的I型跨膜糖蛋白。许多基因的一个有趣特征是在它们的启动子区域5′端有一个CpG岛，这对转录调控很重要。于是，笔者对ACE2基因5′上游2 100 bp序列运用Promoter 2.0预测，得出该基因可能存在1个启动子区，位于800 bp处；Neural Network Promoter Prediction预测分值>0.8的启动子有2个，特别是1 964～2 014 bp的区域，笔者推测可能是人ACE2基因的核心启动子区。核心启动子是结构和功能特殊的调控序列[18]，为转录机制提供高特异性和亲合力的结合位点。我们还需要进一步了解ACE2基因靶心启动子的基因组结构，把转录调节作为靶向干预和新型治疗策略的重点。

然而在过去几十年中，科学家们对ACE2基因启动子的调控研究甚少，在本文中AliBaba 2.1和PROMO在ACE2基因的启动子区域预测到24种转录因子结合位点，包括 HNF-1，IRF，AP-1，YY1，GR，NF-1，GATA-1，C/EBPalpha，USF，SRY及c-Jun 等。HNF-1是可以结合到启动子区且进化上保守的基序[19]，SRY通过介导ACE基因启动子，下调ACE2基因启动子的活性[20]。不足的是软件预测到ACE2基因的启动子区域可能存在转录因子潜在的结合位点，但后续还需要进一步结合实验验证。

Fan等[21]推断ACE2启动子的甲基化异常可能与原发性高血压有关，甚至性别还可能影响ACE2甲基化。甲基化修饰对调节人ACE2基因的转录起始发挥重要作用，从而调节基因表达。本研究采用EMBOSS和MethPrimer两个软件对ACE2基因启动子区CpG岛的分析结果高度一致：即人ACE2基因启动子区有1个CpG 岛，位于5′端调控区2 100 bp 序列的282～558 bp。另外，CpG Finder预测CpG岛也位于90～564 bp，大小为275 bp。

目前，在北京、广东、吉林、深圳等地报告无症状者携带SARS-CoV-2，但专家们对其传播的有效性尚不明确，对联防联控工作构成了重大挑战[22，23]。人们普遍认为人类基因组 DNA包含一定水平的多态性，宿主的遗传背景可能是决定SARS-CoV-2感染的易感性和致病性的重要因素。在非编码基因的调控区，笔者研究证实ACE2存在单核苷酸多态性(SNP)，特别是可能以等位基因特异方式影响基因表达水平。结果表明，亚洲人属中国汉族人(CHB)和日本东京人(JPT)频率最高，而欧美人(CEU)最低。人ACE2基因启动子区还存在3个非同义SNP(nsSNP): rs4830978，rs5934263和rs5936010，基因型C/T或C/G与nsSNP相关。Zhao等[24]单细胞测序发现亚洲人比欧美人具有更高的ACE2表达细胞比例，推测亚洲人属于易感人群。但Chen等[25]认为ACE2在肺中的表达随年龄增长而增加，与性别无关。此外，亚洲人与其他人群在ACE2基因组中没有独特的遗传多态性。但是，未翻译部分的UTR-SNP如何影响基因功能的生化证据仍然很少，nsSNP是否与基因表达和病毒感染的易感性相关还有待深入研究。

总之，COVID-19不断爆发是全球需要面临的一个严重公共卫生问题，迄今仍然缺乏针对 SARS-CoV-2的任何特定抗病毒治疗。瑞德西韦在国内临床试验中特别是对于重症患者的治疗获益有限[26]，不过我国的传统中医药有一定的疗效[27]。本研究中，笔者首次获取ACE2基因的上游序列，预测启动子区域，并且分析了CpG岛分布、转录因子结合位点以及SNP位点分布的特点，为深入探讨ACE2基因启动子在SARS-CoV-2致病机理的关键作用提供了新的线索。