一例鸭金黄色葡萄球菌病微生物质谱方法快速诊断

刘雨，刘蒙达，王晓文，王方昆*

一例鸭金黄色葡萄球菌病微生物质谱方法快速诊断

刘雨1，刘蒙达2，王晓文3，王方昆1*

（1.山东农业大学动物医学院，山东 泰安 271018；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛；3.中华人民共和国聊城海关，山东 聊城）

某蛋鸭场病鸭趾底肿胀和溃烂，关节肿胀，充满脓液，关节面溃烂。为确定引起病鸭死亡病因，从病死鸭脚掌关节滑囊液中分离到细菌，采用细菌培养纯化、布鲁克微生物MALDI-TOF质谱仪鉴定及药物敏感性试验对病原进行研究。结果显示，病原为金黄色葡萄球菌；对氟苯尼考表现敏感，对恩诺沙星、磷霉素、林可霉素表现耐药。本研究分离鸭源金黄色葡萄球菌具有较强的致病性和多重耐药性，为金黄色葡萄球菌感染鸭所致疾病的诊治提供参考。

鸭；金黄色葡萄球菌；质谱方法；实验室诊断

金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属()至少包括有20个种。其中金黄色葡萄球菌是动物的一种重要病原菌，引起各种动物的感染性疾病。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。细菌的易感性与表皮或黏膜创伤的有无、机体抵抗力的强弱、葡萄球菌污染的程度、以及动物所处的环境有密切关系。创伤是主要的传染途径。鸭趾底部皮肤容易发生破损，由于皮肤造成损伤，极易继发葡萄球菌感染。2020年6月，某蛋鸭场突然暴发趾底肿胀和溃烂，经剖检初步诊断为金黄色葡萄球菌感染，采集病料进行细菌培养后，经MALDI-TOF质谱仪鉴定得到金黄色葡萄球菌单菌落，通过药敏实验指导鸭场筛选药物治疗，使疫情得到控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 病鸭为90日龄的育成蛋鸭，地面散养，发病鸭趾底肿胀和溃烂，经送诊病鸭剖检，取鸭掌、粪便、肝脏等病料。

1.1.2 主要仪器 MALDI-TOF质谱仪、37℃恒温培养箱等。

1.1.3 主要试剂 普通培养基、血琼脂培养基、TSB增菌液、药敏纸片、不同规格离心管、固体LB(蛋白胨10g、酵母粉5g/L、琼脂糖15g/L、NaCl 10g/L)、液体LB(蛋白胨10g、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)、TSB(胰蛋白胨大豆肉汤培养基)、50%甘油、70%甲酸、基质HCCA标准溶剂(乙腈:水:三氟乙酸=50:47.5:2.5)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 无菌环境下取新鲜滑囊液一环，在超净台内用接种环于普通LB培养基划板，再倒置于37℃恒温培养箱24h。经MALDI-TOF质谱仪鉴定后，挑取鉴定结果为金黄色葡萄球菌单个菌落分别接种于液体LB培养液和TSB增菌液，37℃恒温培养24h。再取一环TSB增菌液用血琼脂培养基进行纯化，37℃培养24h。

1.2.2 质谱检测 （1）原理：每种微生物都有自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。激光将菌蛋白和HCCA打到电子加速版上，不同菌会出现不同的蛋白指纹图，跟布鲁克菌种库中数据进行对比，从而确定细菌的类型，但不能分型。（2）方法：①挑单菌落涂金属板，加1µl70%甲酸，晾干，再加1µl基质溶液；②取单菌落加300µl无菌水于EP管中混匀，加900µl的无水乙醇，13000转离心2min，弃上清，加70%甲酸乙腈，取上清点板(①和②各为一种方法，本实验中选择方法①)；③将金属板放入仪器内进行检测，根据指纹图谱比对获得结果。

1.2.3 药敏试验 挑取血平板培养基上纯化的单个菌落，用灭菌生理盐水按照一定的比例稀释。用涂抹棒将菌液均匀涂在普通培养基上，后将 10 种药敏纸片有序放置于固定的位置，置于37℃温箱中培养24h后观察结果。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

在普通培养基上生长出白色、湿润、光滑的菌落；在TSB增菌液种呈橙红色浑浊液体，在液体LB中呈乳白色浑浊液体，在血琼脂培养基呈暗灰色、光滑、大小均匀的菌落。

2.2 MALDI-TOF质谱仪鉴定结果

由MALDI-TOF质谱仪测得的待测微生物蛋白指纹图谱与已知微生物标准蛋白指纹图谱对比。

2.3 药敏试验结果

分离的大肠杆菌对氟苯尼考、头孢哌酮、新霉素敏感，对恩诺沙星、磷霉素、林可霉素耐药见附表。

附表 纸片法药敏试验结果 (mm)

抗生素名称氟苯尼考恩诺沙星头孢哌酮新霉素磷霉素粘杆菌素氟苯尼考林可霉素 抑菌环直径2010181610162012 判定结果SRIIRISR

3 讨论

（1）本研究为确诊某鸭场鸭群趾底及关节化脓性炎症的病因，通过剖检病鸭，采集病料进行细菌培养、MALDI-TOF质谱仪鉴定及药敏实验，结果诊断为金黄色葡萄球菌病，经用敏感的氟苯尼考治疗后疫情得到有效控制。整个实验室诊断过程在24h内完成。以往临床病理学中诊断细菌病的实验室方法多使用细菌培养、染色镜检、生化试验、PCR 检测及药敏实验等方法，这些方法繁琐而且耗时较多，整个过程下来至少需要2d；因此，使用微生物MALDI-TOF质谱仪根据临床诊断确诊细菌病的方法具有操作简单、快速、通量高，灵敏度高，准确度好的优点。动物临床病理学中，细菌病的治疗经常使用抗生素，这使得细菌的耐药性越来越严重，为了解决这一问题，人们对耐药性的研究也极为重视，然而，诊断细菌感染性疾病的关键环节往往被忽视，若不做致病菌确诊直接根据药敏试验结果使用抗生素的话，很容易因为其他非致病性菌的干扰导致养殖场滥用抗生素，从而使得耐药性增加，出现后期使用抗生素无效，使养殖场造成了极大的浪费。因此，使用微生物MALDI-TOF质谱仪根据临床诊断确诊致病菌成为帮助牧场患病畜禽精确诊断及合理用药的好办法。（2）近几年相继发生的几起食品安全事件，引起人们对食品安全问题的广泛关注。我国监管部门也越发加强了对食品安全问题的重视。如从药敏实验结果和后期治疗效果可看出，抗生素的滥用对养殖场的危害性极大，通常万古霉素、庆大霉素等可作为治疗大肠杆菌病的首选药物。然而，随着抗生素的广泛使用，细菌耐药程度不断增强并且复杂化，一旦发病很难控制，万古霉素为养殖场带来极大的隐患。很多时候，养殖场突发某种细菌病的情况下，病死动物经剖检进行临床诊断，根据眼观病理变化初步诊断后送检实验室检测，经常会直接进行药敏试验，这时的药敏结果难免是在通常有其他混合感染菌的情况下得出的结果，就会使得药物使用太广泛，虽然具有一定的治疗效果，但却达不到精准的治疗，在这个过程中，从病料中分离到了多种菌，抗生素选择上是针对多种菌的，而实际上只有一种主要致病菌需要分离出来进行药敏试验并根据结果选择抗生素，否则易造成抗生素滥用。这些被滥用的抗生素最终会通过垂直或平行的遗传进化方式在细菌之间产生耐药基因，比如，对四环素类耐药的细菌和对喹诺酮类耐药的细菌因基因改变而在细胞膜上存在外排系统，能将药物从菌体内排出，从而产生耐药性。如果万古霉素是在这种情况下被使用后逐渐产生耐药性的，说明养殖场内所有的细菌很可能都在被万古霉素影响下发生变异，那么，问题就严重了，该场如果暴发其他细菌病治疗起来就会十分困难。同理，其他抗生素药物的滥用也会产生这种后果。人们都知道，很多细菌不光感染动物导致动物发病，也会感染人，这些产生耐药性的细菌如果被在该场工作的人员感染了，治疗起来同样十分困难，进而极大的危害养殖人员的健康，所以为了人畜健康，对动物细菌病应结合临床诊断，从病料分离细菌并进行鉴定后再做药敏试验，这种方法可以有效避免抗生素的滥用。

[1] 韩硕. 全自动快速微生物质谱检测系统鉴定流感嗜血杆菌及其可靠性分析[J]. 名医, 2020(8): 138-139.

[2] 姜彦芬, 王金凤, 李睿文, 等. MALDI-TOF MS方法快速鉴定临床分离的肺炎克雷伯氏菌[J]. 中国动物检疫, 2020, 37(4): 101-105.

[3] 刘振波, 夏苏苏, 康琳, 等. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在病原微生物鉴定中的应用[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2019, 42(3): 225-228.

[4] 何坚, 冯彬. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)的研制及其在微生物快速鉴定方面的应用[A]. 中国化学会、国家自然科学基金委员会. 中国化学会第二届全国质谱分析学术报告会会议摘要集[C]. 中国化学会、国家自然科学基金委员会: 中国化学会, 2015: 310.

[5] 王艳, 阎萍. 质谱仪对临床常见致病菌的快速准确鉴定[A]. 中国微生物学会临床微生物学专业委员会、医学参考报社、宁波大学医学院附属医院. 第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C]. 中国微生物学会临床微生物学专业委员会、医学参考报社、宁波大学医学院附属医院: 中国微生物学会临床微生物学专业委员会, 2015: 247.

[6] 苑文雯, 马洪滨, 陈霖, 等. 质谱仪鉴定革兰氏阴性杆菌的评价[J]. 中国医学装备, 2013, 10(12): 22-24.

[7] 布鲁克公司食品安全检测技术高端解决方案—食品安全和品质的保证[A]. 中国分析测试协会.BCEIA2013分析仪器应用技术报告会论文集[C]. 中国分析测试协会: 中国分析测试协会, 2013: 26.

[8] 胡燕燕, 孙谦, 蔡加昌, 等. 基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪检测KPC型碳青霉烯酶的研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2012(6): 561-565.

[9] 张欣怡, 刘朝阳. MALDI Biotyper微生物快速鉴定与分类新技术[A]. 中国仪器仪表学会分析仪器分会、中国仪器仪表学会农业仪器应用技术分会.2012中国食品与农产品质量安全检测技术应用国际论坛暨展览会论文集[C]. 中国仪器仪表学会分析仪器分会、中国仪器仪表学会农业仪器应用技术分会: 北京雄鹰国际展览有限公司, 2012: 59-60.

（2020–08–28）

S858.32

A

1007-1733(2020)11-0010-03