CRISPR/Cas9技术介导猪基因组单碱基编辑效率的研究

张婷婷 陈涛 李燕莉 杨漫漫 魏强 王然 李林 李勇

摘要：利用國际上最新的两种基于CRISPR/Cas9的BE3（Cytosine base editor，CBE）和ABE7.10（Adenine base editor，ABE）单碱基修饰技术对猪基因组靶基因位点进行编辑效率的分析研究。设计、合成并构建4个猪基因组靶基因位点gRNA表达载体，分别与CBE或ABE共转染PK15细胞，继续培养48 h，结合二代测序技术测定单碱基替换效率和indels发生率。结果表明，单碱基编辑系统BE3和ABE7.10对猪基因组靶位点碱基修饰的活性编辑窗口主要分别为5个核苷酸和4个核苷酸;两套单碱基编辑系统主要对编辑窗口内的目标碱基进行单碱基转换而非indel;两套单碱基编辑系统对猪基因组碱基置换有一定偏好性，其中CMAH、MC1R（1-2）、MC1R（2-1）基因编辑窗口内C→T的效率分别为2.2%、0.4%和1.3%;猪GGTA、MSTN-2窗口内A→G的效率分别为1.4%、1.4%。表明单碱基编辑系统BE3和ABE7.10均能够对猪细胞的基因组靶位点序列进行有效的单碱基置换。

关键词：猪;单碱基编辑;CRISPR/Cas9;BE3;ABE7.10

中图分类号：Q812         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）18-0143-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.029 开

Programmable base editing efficiency study of CRISPR/Cas9-guided

DNA base editors in pig genome

ZHANG Ting-ting1，2， CHEN Tao2，3， LI Yan-li1，2， YANG Man-man2，3，

WEI Qiang2，3， WANG Ran2，3，LI Lin2，3， LI Yong1，2，3

（1. BGI-Shenzhen Sanshengyuan Technology Co.， Ltd.， Shenzhen  518000， Guangdong， China;

2. BGI-Agricultural Application Research Institute， Shenzhen  518000，Guangdong，China;

3.Shenzhen Engineering Laboratory for Genomics-Assisted Animal Breeding， Shenzhen  518000， Guangdong，China）

Abstract： The CRISPR/Cas9-based BE3（Cytosine base editor，CBE） and ABE7.10（Adenine base editor，ABE） were used to analyze and study the editing efficiency of target gene loci in pig genome. Four porcine genomic target gene loci gRNA expression vectors were designed， synthesized and constructed， which were co-transfected into PK15 cells with CBE or ABE， respectively. The PK15 cells were further cultured for 48 h， and single-base replacement efficiency and indels incidence were determined by second-generation sequencing technology. The results showed that the active editing Windows of the single base editing system BE3 and ABE7.10 were 5 nucleotides and 4 nucleotides， respectively; Both BE3 and ABE7.10 were mainly contributed to single base conversion but not indel; The two sets of single-base editing systems showed certain preference for base replacement in pig genome. In the CMAH， MC1R（1-2） and MC1R（2-1） gene editing Windows， the efficiency of C→T was 2.2%， 0.4% and 1.3%， respectively; The efficiency of A→G in pig GGTA and MSTN-2 was 1.4% and 1.4%， respectively. It is shown that both BE3 and ABE7.10 can perform effective single base substitutions for genomic target sequences in pig cells.

Key words： pig; single base editing; CRISPR/Cas9; BE3; ABE7.10

CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）-associated system，Cas9）系统作为第三代基因编辑工具已广泛应用于各物种的基因修饰，包括小鼠[1]、猪[2]、牛[3]、羊[4]、水稻[5]、拟南芥[6]、烟草[7]、玉米[8]、小麦[9]等。该系统是在sgRNA的引导下Cas9核酸酶造成基因组双链断裂，断裂后的基因组进行非同源末端修复（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源末端修复（Homology-directed repair，HDR）来实现基因编辑。绝大部分DNA修复是通过NHEJ的方式进行，这种修复通常会产生大量的小片段随机插入或缺失，抑或造成大片段缺失，进而导致基因的失活[10]。然而，在现实的农业和医学研究领域中，导致农艺性状或人类遗传性疾病的原因则更多的是因点突变引起的功能获得或缺失，如约2/3的人类遗传疾病都是由单碱基突变造成，这种单碱基突变却是常规CRISPR/Cas9系统介导双链断裂所不能完成的。尽管通过同源重组载体或ssDNA介导的HDR完成，但由于细胞内同源重组的发生概率极低[11]，使得这类碱基替换方法的效率极低。

基于CRISPR/Cas9系统发展起来的单碱基替换技术较多。利用Cas9突变体（nCas9）分别与大鼠胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC）融合，开发出在DNA双链不发生断裂的情况下可以实现更加安全、高效、精准的单碱基编辑器（Cytosine base editor， CBE），而且其效率远高于DSB引起的HDR修复方式[12]。Gaudelli等[13]把Escherichia coli来源的tRNA腺苷酸脱氨酶（TadA）与nCas9融合，经过多轮选择和蛋白修饰后，开发出可以将腺嘌呤精准地转化成鸟嘌呤的新型单碱基转化系统（Adenine base editor， ABE）。且随着生物技术的发展，形成了更多高效特异的单碱基替换系统[14，15]。目前，基于CRISPR/Cas9系统开发的单碱基替换系统BE3和ABE7.10已在小鼠[16]、斑马鱼[17]、人类干细胞[18]、水稻[19]、小麦[20]等物种中得到广泛应用。

猪作为中国最为重要的农业动物，因其与人在解剖、生理、病理以及基因组序列方面高度的相似性，已成为人类相关疾病研究的理想试验模型和异种器官移植模型。现已通过改造猪基因组开发了一系列的人类疾病模型豬，如内源性转录病毒敲除模型[21]、亨廷顿舞蹈症模型[22]、动脉粥样硬化模型[23]、杜氏营养不良模型等[24]，以及伴随单碱基替换系统而制备出的模拟人类点突变的疾病模型猪[25，26]。

鉴于单碱基替换系统技术所具备的应用价值，而该技术猪基因组编辑中却没有关于活性编辑框、单个碱基替换效率、碱基替换倾向性及脱靶等方面的报道。本研究选取了猪基因组中4个不同的基因作为靶位点，构建其对应的gRNA表达载体，以最新发展起来且应用广泛的单碱基替换系统 BE3和ABE7.10为介质，并结合靶向基因组测序技术，评价猪基因组特定序列的碱基替换结果。同时，选用4条人源序列开展平行性阳性对照试验，详细对比分析了两项基于CRISPR/Cas9技术的BE3和ABE7.10单碱基编辑技术在猪细胞基因组中的修饰效率和缺失、插入效率。本研究成果将为后续利用单碱基编辑系统在模型猪体内研究、治疗人类单点突变疾病提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及载体 PK15细胞购于美国模式培养物寄存库（ATCC）;293T细胞由深圳国家基因库母婴健康研究中心杨熹提供;CRR质粒由深圳华大三生园科技有限公司实验室设计并合成;pCMV-ABE7.10质粒、pCMV-BE3质粒购于Addgene。

1.1.2 主要试剂 无内毒素质粒提取试剂盒购于Omega公司;Lipofectamine2000转染试剂盒购于Invitrogen公司;MGIEasy DNA文库快速制备试剂盒购于深圳华大智造科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA设计及活性鉴定 4条阳性对照sgRNA-2TAT、sgRNA-HBG1、sgRNA-EMX1、sgRNA- HEK293T site3序列均来自于文献[12]和[13]。设计并合成猪GGTA、MSTN、CMAH、MC1R、MYH7等5个基因的sgRNA序列，sgRNA序列信息见表1。sgRNA正向链及其互补链按照体积比1∶1变性退火（变性退火程序：95 ℃，10 min;25 ℃，30 min），形成带有黏性末端的双链核苷酸，与经BsaI酶切、胶回收纯化后的CRR骨架载体连接。构建的CRR表达载体经过Sanger测序验证连接正确后，无内毒素试剂盒提取质粒，用于转染PK15细胞验证剪切活性。

CRR-sgRNA表达质粒与pCMV-spCas9质粒共转染，当PK15细胞汇合度50%时进行脂质体转染，转染48 h后分别收集细胞并提取基因组DNA（Genomic DNA，gDNA），PCR扩增sgRNA靶点附近序列，产物经T7程序变性退火后用T7核酸内切酶I酶切，sgRNA活性鉴定引物见表2，反应体系如下。

PCR反应体系：gDNA 0.1 μg，premix Ex Taq 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O补足体积至20 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性1 min;98 ℃变性10 s，55～62 ℃（Tm）退火30 s，72 ℃延伸10 s，32个循环;再于72 ℃延伸2 min;4 ℃保存。

T7变性程序：95 ℃预变性10 min;以2.0 ℃/s自95 ℃降至85 ℃;以-0.3 ℃/s 自85 ℃降至25 ℃;25 ℃ 1 min。

T7酶切反应体系：PCR产物18 μL，NEB      Buffer2 2 μL，T7核酸内切酶I 0.2 μL。反应条件37 ℃，45 min。

1.2.2 细胞转染 PK15细胞、293T细胞复苏至24孔板，细胞汇合度达50%后进行转染，转染策略见表3。DNA转染总量500 ng，单碱基替换载体和CRR-sgRNA表达载体转染比例为3∶1。根据脂质体说明书进行转染，转染后细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，转染后24 h更换1次培养基。

1.2.3 靶向文库构建及测序 转染48 h后，收集细胞，提取基因组DNA，靶向扩增引物进行扩增。PCR反应体系：gDNA 5 ng，PrimeSTAR 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O补足体积至20 μL。

PCR反应程序：98 ℃预变性1 min;98 ℃变性10 s，55～60 ℃（Tm）退火30 s，72 ℃延伸10 s，30个循环;再于72 ℃延伸2 min;4 ℃保存。靶向扩增引物序列见表4。

取5 μL扩增产物于1.8%琼脂糖凝胶中检测，剩余产物纯化后进行文库构建。

使用Qubit？ dsDNA HS Assay Kit检测PCR回收产物浓度，均一化至60 ng/μL，总体积50 μL，使用MGIEasy DNA文库快速制备试剂盒进行文库制备。文库环化产物使用Qsep100检测片段长度，Qubit？ ssDNA Assay Kit测定浓度，使用BGISEQ-500平台进行PE100测序。

1.2.4 测序数据分析 数据使用SOAPnuke-1.5.0进行过滤，使用BWA-0.7.12进行序列比对，用Samtools1.7的mpileup模块转换格式后统计结果。

2 结果与分析

2.1 CRR-sgRNA表达载体构建及活性验证结果

将猪靶基因GGTA、MSTN、CMAH、MC1R、MYH7相关sgRNA，阳性对照2TAT、HBG1、EMX1、HEK293T site3相关sgRNA，分别连入CRR骨架载体中，经Sanger测序验证，表明sgRNA均成功连接到CRR骨架载体中（图1）。

将构建成功的猪靶基因相关sgRNA表达载体与pCMV-spCas9表达载体共转染至PK15细胞中，转染48 h后提取基因组DNA，用鉴定引物扩增并进行T7酶切鉴定，活性鉴定结果表明，7条猪靶基因相关的sgRNA均有剪切活性，其中MSTN-1活性较弱（图2）。

2.2 靶向文库构建

靶向扩增引物分别扩增靶向位点及其附近序列，阳性对照及样品平行扩增3份，电泳结果（图3）显示，目的片段大小正确，样品目标条带单一、特异性较好。

2.3 单碱基替换效率分析

BE3单碱基编辑系统中的胞嘧啶脱氨酶的酶活性窗口包含了5个核苷酸，一般是距离PAM序列最远端的第4至第8个核苷酸[12]。对靶序列测序结果进行分析，结果（图4A至图4F）显示，CMAH、MC1R（1-2）、MC1R（2-1）、阳性对照HEK293Tsite3的碱基替换主要发生在活性编辑窗口内，其中CMAHC5→T5效率为2.2%（图4A），MC1R（1-2）C7→T7效率为0.4%（图4B）;MC1R（2-1）C7→T7效率为1.3%（图4C），阳性对照HEK293T site3 C4→T4和C5→T5的效率分别为11%和10%（图4E）。相比而言，另一个阳性对照EMX1基因窗口区碱基替换效率极低，C6→T6效率仅为0.02%（图4D）。

ABE7.10单碱基编辑系统中的腺嘌呤脱氨酶的酶活性窗口包含了4个核苷酸，一般是距离PAM序列最远端的第4至第7个核苷酸[13]。对靶序列测序结果进行分析，结果（图5A至图5F）显示，样品GGTA和MSTN-2、阳性对照2TAT和HBG1其碱基替换主要发生在活性编辑窗口内，其中GGTA A7→G7的效率为1.4%（图5A），MSTN-2 A6→G6的效率为1.4%（图5C），2TAT A5→G5效率为9.6%（图5D），HBG1A7→G7的效率为1.2%（图5E）。相比而言，MSTN-1的单碱基修饰效率极低，窗口区A→G效率仅为0.01%（图5B）。

鉴于单碱基修饰系统极低的indels发生率，同时设计了常规CRISPR/Cas9的对照，并通过高通量测序检测indels发生率，结果（图4F、图5F）显示，除阳性对照HEK293T site3有2.2%的indels比例外，其他组都远低于常规CRISPR/Cas9组，这说明单碱基编辑后的样品主要发生碱基替换。

3 讨论

单碱基修饰是近年来发展最为迅速的基因编辑技术之一，它整合了Cas9蛋白的靶向性和脱氨酶堿基替换修复的特点，为农业或生物医学单点、多点特定碱基定向突变模型制备提供了高效的技术手段[20，27-29]。本研究利用BE3和ABE7.10两套单碱基编辑系统对4个猪基因组靶位点进行单碱基修饰。结果表明，BE3和ABE7.10两套单碱基编辑系统都能对猪靶基因进行有效的单碱基修饰，且碱基转换主要发生在活性编辑窗口内，这与该基因编辑系统在其他物种中的报道类似。只不过在本研究中单碱基替换效率较低，4个猪靶基因区域碱基修饰最高比例仅有2.2%，略低于其他文献报道中的转换效率[12，13]。但是在同等试验条件下，在人293T细胞中对4个基因受BE3和ABE7.10作用而发生单碱基修饰的效率也偏低，整体而言，以此作对照并不影响本研究关于活性编辑框、单个碱基替换效率、碱基替换倾向性在猪和人基因组中进行差异比较与分析的结果。此外，BE3-MC1R（1-2）位点、BE3-EMX1位点以及ABE7.10-MSTN-1未能发生单碱基修饰可能与gRNA活性有关，没有加入单碱基编辑效率的数据分析之中。本研究发现，BE3系统碱基替换效率整体略高，ABE7.10的要低些。大量研究表明，体外基因编辑效率与细胞转染效率高度正相关，无论是核转染、电转染或者通过病毒载体介导的转染，都能实现高效的载体导入，从而获得高效的基因编辑结果[30-32]。

CBE和ABE堿基编辑系统都能够在不使DNA双链断裂的情况下，精准、高效地进行目标碱基的替换，精确地生成或者修复点突变。这在本研究中也有体现，以MYH7和MSTN为靶点测定了CRISPR/Cas9基因修饰发生的indel概率为阳性对照，试验结果表明，经过BE3和ABE7.10单碱基编辑系统编辑后，除HEK293T site3有2.2%的indels比例外，其他组indels都在1.0%以下，编辑产物indels的发生率都比CRISPR/Cas9系统编辑产物indels的发生率低，结果与文献报道的结果相符合[12，13]。此外，本研究中样品以及阳性对照都出现了不同程度的编辑窗口以外的碱基转换，结合在小鼠、猪等多个物种中进行的多项研究[16，25，26，33]显示，CBE编辑系统用于碱基转换时，除了目标碱基C-T转换的同时还会伴随着少量的C-A或C-G的转换。鉴于CBE碱基编辑系统中所用的酶是突变体dCas9，一种缺乏双链断裂能力的核酸酶，可以排除Cas9断裂双链DNA后引起indels，推测是当编辑窗口内的碱基脱氨基以及碱基切除修复时，把目标碱基做转换的同时引发了碱基的插入或缺失[27]。

在位点活性评价方面，与常规CRISPR/Cas9基因编辑系统依赖T7酶检测不同，单碱基编辑系统主要通过高通量测序来检测碱基替换比率。本研究发现采用靶向PCR建库的方法可以较为高效地检测低频碱基变异，利用该方法最重要的是确保扩增片段的特异性和高保真性。此外，在建库过程中，接头连接时容易发生片段自连，从而产生非特异性条带，但这些条带在建库后纯化中可去除，不会影响后续的测序。最后，相比高通量测序一个反应上百GB的数据而言，靶向片段的测序数据极少，可以与其他类型的测序样本进行pooling来降低检测成本。

总之，本研究利用基于CRISPR/Cas9技术的BE3和ABE7.10两套单碱基编辑系统对PK15细胞中4种不同基因靶位点进行了研究，探索这两套碱基修饰系统对猪基因组碱基的编辑情况以及编辑效率。结果表明，BE3和ABE7.10系统都能在体外试验中对猪基因组中靶基因产生一定的编辑效果，这将为科研工作者研究基因在猪细胞内的生物学功能、为创制人类单碱基突变基因病的小型猪动物模型提供重要生物技术基础。

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