紫外分光光度法测定烤烟挥发油溶液浓度

王柯涵 向欢 杨懿德 张永辉 曾淑华 杨民烽 郭仕平 刘雷

摘要：为建立利用紫外分光光度法测定烤烟挥发油溶液浓度方法，先用同时蒸馏萃取方法得到烤烟挥发油，再用二氯甲烷将其稀释成梯度溶液，紫外分光光度扫描，并确定工作波长，以此建立烤烟挥发油浓度与其紫外吸光度间的线性回归方程。结果表明，烤烟挥发油的紫外光吸收带在225～245 nm，239 nm最适合作为测定烤烟叶挥发油溶液浓度的工作波长，线性回归方程为y = 0.250 1 x + 0.039 3，R2=0.999 3，且有很好吸光度重复性（RSD<0.5%）;所得线性工作曲线的LOD为0.153 g/L，LOQ为0.464 g/L。

关键词：烤烟;挥发油;紫外光;分光光度法;定量

中图分类号：O69;S572         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）18-0116-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.023

Determination of the concentration of flue-cured tobacco

volatile oils by UV-spectrophotography

WANG Ke-han1，2，XIANG Huan1，3，YANG Yi-de4， ZHANG Yong-hui5，

ZENG Shu-hua1，YANG Min-feng6，GUO Shi-ping6，LIU Lei1

（1. Agricultural College of Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China; 2.Shifang？Bureau？of？Development Reform and Sci-tech， Deyang 618400， Sichuan， China; 3.Sichuan Tobacco Corporation Deyang Branch， Deyang  618400， Sichuan， China; 4. Sichuan Tobacco Corporation Yibin Branch， Yibin  644000， Sichuan， China; 5.Sichuan Tobacco Corporation Luzhou  Branch， Luzhou  646000， Sichuan， China; 6.Sichuan Provincial Tobacco Company， Chengdu  610041， China）

Abstract： To determining the concentration of volatile oils solution extracted from flue-cured tobacco leaves， a method based on UV spectrophotometry was researched. Volatile oils were extracted by simultaneous distillation and diluted with dicholormethane to prepare a set of gradient solutions. Each solution was scanned by UV spectrophotomet. The best working wavelength was selected to establish linear regression equation between the concentration of volatile oil and its ultraviolet absorbance. Results showed that the volatile oils had a large absorption spectrum between 225～245 nm. The best analysis wavelength was 239 nm， the linear relationship was      y =0.250 1x + 0.039 3， R2=0.999 3. Its relative error of was less than 0.5%， the limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） of the working curve were 0.153 g/L and 0.464 g/L separately.

Key words： flue-cured tobacco; volatile oils; ultraviolet light; spectrophotography; determination

煙叶油分是指烟叶组织细胞内含有的柔软半液体或液体物质，在烟叶外观上反映为油润、丰满、枯燥的程度。油分是烟叶分级工作中重要的分级因素，也是衡量烟叶品质的重要指标[1，2]。烤烟油分是一个概括性极强的品质因素，其中涉及的化学成分极为复杂，主要可分为挥发油组分和非挥发油组分。烟草非挥发油组分中主要有油脂、树脂、蜡质、类脂物、甾醇以及色素等;而挥发油（Volatile oils）则是一类具有挥发性的芳香气味油状物质的总称。烟叶挥发油主要包括低分子的烃类、酚类、醇类、醚类、酮类、醛类、酸类、酯类等，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，在常温下即可散发出芳香气味[3];是体现烟叶优良商品特性的重要物质，影响着烟叶的外观品质、感官品质和物理特性[4]。

目前，关于烤烟挥发油的研究主要关于提取方法和某些具体物质成分的定性分析、定量分析[5，6]。将烤烟挥发油作为一个整体来研究其含量测定的方法尚属少见[7]。应用较多的挥发油定量分析方法是称重法，即将经蒸馏萃取得到的挥发油进行除水干燥和有机溶剂挥发后称重求出其含量[8，9]。研究表明，称重法中蒸馏提取、溶剂挥发、物质干燥、称重等操作过程耗时较长，并易在操作中引入测量误差。

紫外分光光度法被广泛应用于物质的定量分析，在植物挥发油定量分析工作中已有应用[10，11];相较于其他检测方法如GC-MS等，其优势在于无需昂贵的仪器设备，且具有操作简单、高效和低成本等特点。挥发油中含有许多萜烯类物质，大多具有吸收紫外光的特性;但将此特性应用于烤烟的初烤烟叶挥发油含量测定上尚鲜见报道。本研究通过测定不同浓度烤烟挥发油溶液的紫外光吸收光谱，比较筛选出适用于测定烤烟挥发油浓度或含量的最佳工作波长，以此建立拟合度高的线性工作曲线，旨在为建立烤烟挥发油快速、准确的定量分析方法提供参考，为分析烟叶品质提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烟叶材料：烤烟品种云烟87的初烤烟叶（C3F）。

试剂：无水硫酸钠、二氯甲烷、氯化钠（AR，成都市科龙化工试剂厂）。

1.2 仪器与设备

双热源同时蒸馏萃取器;JJ124BC型电子天平（感量0.000 1 g，深圳市朗普电子科技有限公司）;DHG-9246型烘箱（上海精宏实验设备有限公司）;UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备 将烟叶置于40 ℃烘箱内烘5～6 h后去梗粉碎，过60目筛后置于密封袋内保存。

1.3.2 烤烟挥发油的提取 采用同时蒸馏萃取法提取烤烟挥发油[12]，向同时蒸馏萃取装置的蒸馏大烧瓶（500 mL）中加入10 g样品、150 mL去离子水和20 g氯化钠，在萃取液富集端的小烧瓶（100 mL）中加入25 mL二氯甲烷;用两个热源同时加热大、小两只烧瓶，并保持二者微沸状态3 h;经冷却后将溶有烤烟挥发油的二氯甲烷回收液倒入三角瓶（100 mL）中，加入5 g 无水硫酸钠以除去其中的水分;经过滤去除硫酸钠晶体后将二氯甲烷回收液定容至100 mL，作为烤烟挥发油溶液的母液。

准确移取一定体积V1（30～40 mL）的挥发油母液，注入已知恒定重量（m1）、容积为50 mL的试管中，将试管置于30 ℃环境中自然通风24 h以上，待二氯甲烷挥发完全后准确称得装有浓缩挥发油的试管总重量（m2）。烤烟挥发油母液浓度C0=（m2- m1）/ V1。

1.3.3 紫外光谱分析 经计算后取适量的母液，并以二氯甲烷作稀释溶剂，分别配制出浓度为母液浓度（C0）的10%、20%、40%、60%和80%的5个梯度溶液各10 mL。以二氯甲烷作为空白，用UV-2450型紫外可见分光光度计扫描后得到各梯度溶液和母液的紫外吸收光谱。

1.3.4 数据分析 用Excel软件处理数据，以挥发油梯度溶液的吸光度为因变量、挥发油溶液的浓度为自变量进行线性回归分析，绘制烤烟挥发油溶液浓度定量分析的工作曲线，并进行回归模型误差分析。

2 结果与分析

2.1 烤烟挥发油溶液的紫外光谱

烤烟挥发油中含有大量能吸收紫外光的成分，如萜类、烯类等，其在紫外光谱中必然出现吸收峰[13]。为了解烤烟挥发油溶液的紫外吸收光谱情况，经扫描得到了6个不同浓度的烤烟挥发油溶液在200～400 nm的紫外吸收光谱，结果如图1所示。不同浓度的烤烟挥发油溶液紫外吸收光谱中都只有1个明显的吸收带，且都在225～245 nm范围内;随着挥发油溶液浓度的增加，各梯度溶液吸收峰值相应增大;但最大吸收峰的波长所在位置却并不固定，而是随溶液浓度的增大，最大吸收峰的波长表现出明显的波长增大现象（即发生红移）。

2.2 工作波长的选择

通常采用分光光度法进行物质定量分析时是以待测物的最大吸收波长作为工作波长，并以被测物含量（浓度）为自变量、最大的吸收波长的吸光度为因变量，从而建立计算被测物含量（浓度）的回归模型[14]。本研究中6個不同浓度的烤烟挥发油溶液在225～245 nm的吸光度及最大吸收波长变动的情况见表1所示。随着烤烟挥发油梯度溶液由母液浓度（C0）的10%逐渐增大到100%，6个溶液的最大紫外吸收波长也由230 nm逐渐增大、最后移动到233 nm处。鉴于最大吸收波长的不稳定状态不宜将其作为工作波长。有研究表明，可以利用非最大吸收波长处的吸光度建立待测物质的定量标准曲线[15]。回归方程的决定系数（R2）反映了回归方程对各观测点拟合程度，R2越高拟合度越好[16];根据拟合线性方程的R2高低可筛选出最佳工作波长。为探索最大波长以外是否有恰当的波长位置可以选为工作波长，本研究求出了烤烟挥发油梯度溶液与其在225～245 nm每个波长下吸光度的线性回归方程决定系数，结果见表1。在236～241 nm范围内二者的线性回归方程决定系数都在0.999以上;其中239 nm处的吸光度与其浓度间的线性回归方程决定系数最高，达到0.999 29，可见烤烟挥发油溶液在239 nm处的吸光度的变化最能准确地反映其浓度，从而确定239 nm为最佳工作波长。

2.3 重复性分析

为检测不同浓度的烤烟挥发油溶液在239 nm处吸光度的重复性，测定了其在239 nm处的吸光度，每个梯度溶液的样品被重复测6次。结果表明，不同浓度梯度溶液吸光度的相对标准偏差（RSD）均较小，为0.079%～0.468%（表2）;说明不同浓度的烤烟挥发油溶液在239 nm处吸光度有较好的重复性。

2.4 定量工作曲线的建立

[13] 张小全，杨志晓，李钦奎，等. 分光光度法定量测定烟草叶面分泌物含量研究[J]. 华南农业大学学报，2011，32（4）：18-20.

[14] 魏福祥，韩 菊，刘宝友. 仪器分析原理及技术[M]. 第2版. 北京：中国石化出版社， 2011.

[15] 张 华，刘志广. 仪器分析简明教程[M]. 辽宁大连： 大连理工大学出版社， 2007.

[16] 潘省初. 计量经济学中级教程[M]. 第2版. 北京： 清华大学出版社， 2013.

[17] 鲁 静，付凌燕，王 旭. 质量分析方法验证中检出限和定量限测定方法探讨[J]. 中国药品标准， 2012， 13（1）： 33-35.

[18] MAJI A K，MAITY N，BANERJI P，et al. A validated RP-HPLC-UV method for quantitative determination of puerarin in pueraria tuberosa DC tuber extract[J]. Pharmaceutical methods，2012，       3（2）：79-83.

[19] 禹 珊， 郭强胜， 王会琳， 等. 定量核磁共振波谱法同时测定中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量[J]. 分析化学， 2015（1）： 69-74.

[20] ABEBE B. Spectrophotometric method for the determination of caffeic acid complexation and thermodynamic properties[J]. International journal of biophysics， 2012， 2（2）： 12-17.

[21] BOLOTIN P A， BARANOVSKY S F. Evstigneev spectrophotometric investigation of the hetero association of Caffeine and thiazine dye in aqueous solution[J]. Spectrochimica acta part A， 2006（64）： 693-697.

[22] JOSEPH J，ELUVATHINGAL D， JEMMIS. Red-， Blue-，or No-Shift in hydrogen bonds： A unified explanation[J]. Journal of American chemical society，2007，129（15）： 4620-4632.

[23] 潘中達， 赵保丹， 周 进. 水溶液中染料吸光度与浓度的非线性关系[J]. 实验室研究与探索， 2014， 33（2）：22-26.

[24] BARANOVSKII S F， BOLOTIN P A. Association of riboflavin， caffeing and sodium salicylate in aqueous solution[J]. Journal of applied spectroscopy， 2007， 74（2）： 211-218.

[25] 殷海青. 光度分析中工作曲线偏离朗伯—比尔定律的原因[J]. 青海师专学报， 2004， 24（5）： 63-66.

[26] 陈 静， 涂 莉， 林学东， 等. 改进布洛芬片溶出度的测定方法[J]. 华西药学杂志， 2005， 20（1）： 64-65.

[27] 高宏建， 张献忠， 钟建军， 等. 水蒸汽蒸馏法提取烟草精油的研究[J]. 食品工业科技， 2011， 31（10）： 388-390.