寒葱咀嚼片的制备及其对肝损伤小鼠转氨酶活性的影响

韩 蕊， 王思涵， 张 先， 李范洙

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

寒葱(Allium Victorialis L.)学名茖葱，别名旱葱、鹿耳葱，为百合科多年生草本植物[1]，多鳞茎长椭圆形，鳞茎皮成丝网状，叶具长柄，长卵形或长椭圆形，全缘，质软而平滑，稍带粉白色，平行脉。主要分布在东北的长白山地区和大小兴安岭，生于阴湿山坡、林下、草地或沟边，地上部植株可供食用[2]，具备独特的大蒜、韭菜和大葱等风味，作为山野菜鲜食或做成腌制菜被广为食用。

寒葱营养丰富，鲜叶中蛋白质含量约4%，Vc含量250 mg/100g，脂肪含量0.4 mg/100g，还含有丰富的矿物质[3-5]。且寒葱中含有多种活性成分，主要为含硫化合物、黄酮类化合物、甾体化合物、皂苷等[6]，对寒葱提取物或活性成分功能性研究结果表明，寒葱具有良好的抗氧化和抗菌活性[7-9]、抗动脉硬化[10]、降血脂和降胆固醇作用[11]，并且黄翠菊[12]研究发现，寒葱提取物对酒精导致的小鼠肝损伤具有良好的保护作用。虽然对寒葱化学成分及活性研究有了一定的进展，但对寒葱深加工方面的研究寥寥无几。该文探讨了利用寒葱提取物制备咀嚼片的工艺，并进一步研究了寒葱咀嚼片对急性肝损伤的辅助保护作用，为寒葱保健食品的开发提供有效的依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1) 寒葱 于2018年采自吉林省延边地区的野生寒葱；乳糖、糊精、甘露醇、MCC均为食品级。

2) 雄性小鼠 33只昆明鼠，月龄约4月，体重(28±4.5) g，购于吉林省延边大学动物饲养中心。将小鼠饲养在干净、环境适宜的代谢笼里，温度保持在22 ～26 ℃，湿度约40%～50%，自然光照，定期更换便料，自由饮食。

3) 试剂 芦丁、槲皮素、山奈酚标准品、色谱级甲醇购自sigma 公司；ALT试剂盒、AST试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；水飞蓟素购自湖南千金协力药业有限公司；四氯化碳购自天津格里斯医药化学技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

1) HP 1100高效液相色谱系统 配有可变波长紫外检测器和Rev.A.06.03色谱工作站，美国惠普公司。

2) 质构仪 TMS-PR，美国FTC公司。

3) 片剂脆碎度测定仪 CS-2，天津天河分析仪器有限公司。

1.3 寒葱提取物的制备

取寒葱鲜叶1 kg，用15 L蒸馏水浸泡24 h后回流提取2 h，过滤；过滤后的滤渣加入10 L蒸馏水中2次回流提取1 h，过滤；所得滤渣加入5 L蒸馏水中再次回流提取30 min，过滤；合并3次滤液，减压浓缩至浸膏状，将所得浸膏冷冻干燥，粉碎，过120目筛备用。

1.4 寒葱提取物中黄酮类物质含量的测定

1) 色谱条件 色谱柱：C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：0.3%磷酸-甲醇(35∶65)；检测波长：360 nm；流速：1 mL/min；循环时间：40 min；进样量：10 μL；柱温：40℃。

2) 供试溶液制备 芦丁、槲皮素和山奈酚标准品用色谱级甲醇溶液配制成1 mg/mL的标准溶液待测。精密秤取寒葱提取物100 mg，加入1 mL色谱级甲醇超声加热溶解，待冷却，离心后过0.45 μm的微孔滤膜，得到供试样品溶液。

1.5 寒葱咀嚼片制备工艺研究

1) 咀嚼片制备工艺流程 该试验采用湿法制粒的方法制备咀嚼片[13-15]，在原辅料经润湿剂70%乙醇粘合后进行湿法制粒。制备工艺流程如下：

寒葱粉、填充剂→混合→制湿粒→干燥→整粒→压片→成品

2) 咀嚼片填充剂种类和比例的筛选 在预实验的基础上，选取的填充剂以乳糖为主，并用糊精或者MCC(微晶纤维素)作为复配。该实验中，控制寒葱提取物的添加量为10%，其余部分用填充剂按照不同的比例补足[16]。

3) 寒葱提取物添加量的筛选 寒葱提取物为黄褐色，寒葱的特征味浓郁，黏性较大，在使用过程中需考察其用量。主要通过感官评价以及硬度指标，筛选出寒葱提取物的适宜添加量。

4) 甘露醇添加量的筛选 为掩盖寒葱提取物的刺激性气味，增强寒葱提取物咀嚼片的可食性，添加一定量的甘露醇，用于调整咀嚼片的口感味道。通过感官评价以及硬度指标，确定适宜的添加量。

5) 杀菌工艺的研究 采用微波、紫外线、臭氧及其复配的处理，对压片前的颗粒进行杀菌处理，同时设置空白处理组，测定咀嚼片的菌落总数和大肠菌群数。

6) 咀嚼片的质量检查 按照中国药典的相应规定对咀嚼片的片重差异限度、硬度和脆碎度进行测定。

7) 指标的测定方法 ①硬度的测定：用质构仪测定片剂硬度。具体参数如下:预测试速度1 mm/s；触发力5.0 g；测试速度2 mm/s；返回速度5.0 mm/ s；测试距离1 mm；测试周期1。②休止角的测定：取压片前的颗粒5 g，自具0.75 cm小孔的漏斗中距平板玻璃平面10 cm高度落于玻璃平面上，测定堆积高度(H)和堆积半径(r)，并按tanφ=H/r求出休止角φ，以φ表示颗粒的流动性，φ ≤30°且φ愈小，流动性愈好[17]。③片重差异限度测定：随机取10片寒葱咀嚼片，用分析天平精确称每片的质量，即片重差异= (每片片重-平均片重) /平均片重×100%。 ④脆碎度的测定：取若干片咀嚼片使其总重约为6.5 g，用吹风机吹去片剂脱落的粉末，精密称重，置片剂脆碎度测定仪筒中，转动100次。取出，同法除去粉末，精密称重, 计算减失重量百分比[18]，即为脆碎度。⑤菌落总数和大肠菌群数的测定：按照GB4789.2-2010和GB4789.3-2010中的方法分别测定菌落总数和大肠菌群数。

8) 感官评价方法及标准 由从事食品专业的人员组成10人评定小组，主要针对寒葱咀嚼片口感、味道、组织形态进行评定[19]，评分标准如表1所示，按照相应权重计算感官评分，取平均值。

表1 寒葱咀嚼片感官品质评分标准Table 1 Sensory quality scoring standards for Allium Victorialis chewable tablets

1.6 寒葱咀嚼片肝保护作用研究

1.6.1 小鼠急性肝脏损伤模型的建立

将雄性小鼠适应性饲养3 d，之后随机把33只小鼠分为正常组(n=5)、模型组(n=10)、阳性组(n=9)、咀嚼片组(n=9)。每天早上8点对小鼠经口灌胃，正常组与模型组每日灌胃等体积的生理盐水，阳性组、咀嚼片组灌胃剂量分别为0.1 g/kg·d和3 g/kg·d，连续灌胃30 d后，除正常组外其余各组腹腔注射10%四氯化碳2 mL/kg[20]。阳性组所用药物为水飞蓟素。

1.6.2 小鼠肝脏系数的测定

腹腔注射四氯化碳16 h后，对各组小鼠经眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出肝脏，置于4 ℃生理盐水中洗去残血并除去表面结缔组织，滤纸吸净表面水分后，采用精密天平称取各组织湿重并记录；称重之后，部分肝脏浸泡于10%的甲醛中，部分冷存于-80 ℃备用。

肝脏系数计算方法：肝脏系数=肝脏重量/体重×100%

1.6.3 小鼠血清中转氨酶活性的测定

1) 血清的采集 腹腔注射16 h后，对各组小鼠进行摘除眼球取血，采血时间为上午9:00～11:00。每只采血量5～10 mL,静置4 h以上，待血液凝固、纤维蛋白收缩后于15 mL离心管中，利用离心机在4 000 r/min条件下离心10 min，取上层血清约1 mL，平均分放在4个EP管，贴好标签，最后将血清样本储藏于-20 ℃冰箱。

2) 转氨酶活性的检测 血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的测定按照Elisa试剂盒说明书进行操作。

1.6.4 小鼠肝脏组织形态的观察

将各组小鼠肝脏取出清洗后，先放在培养皿的中心，然后把培养皿放在标准纸上，让培养皿与已标定的两条互相垂直的线相切，然后进行拍照，每个样品拍3张照片。

1.6.5 小鼠肝脏组织病理的观察

各组小鼠肝脏先放入10%的甲醛溶液里浸泡4 d，浸泡后肝脏组织切成3 mm2大小，脱水，利用石蜡包埋机完成灌蜡操作，然后切片机切成5 μm薄片，最后进行HE染色。制作好的肝脏切片置入光学显微镜(Ti2，日本尼康公司)下观察即可。

1.7 试验数据分析

实验数据用Graphab Prism program5.0的软件处理，采用Column方法进行数据间的显著性分析，以*(P<0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 寒葱提取物中黄酮类化合物的含量

黄酮类化合物是植物源天然次生代谢产物, 是葱属植物中的一种重要的生物活性物质，葱属黄酮以芦丁、槲皮素与山奈酚为主[21]。因此采用HPLC法对寒葱提取物中黄酮类化合物进行了分析。由图1可以看出，在寒葱提取物中检测出芦丁、槲皮素、山萘酚这3种成分，这3种物质的含量分别为4.997、0.695和2.481 μg/g，芦丁含量最多，其次是山奈酚，槲皮素含量最低(表2)。

图1 寒葱提取物与芦丁、槲皮素、山奈酚标准溶液的色谱分析图Fig.1 The chromatographic analysis diagram of the extract of Allium Victorialis and the standard solution of rutin, quercetin and kaem pferol

表2 寒葱提取物中黄酮类物质含量

2.2 寒葱咀嚼片的制备

2.2.1 填充剂的筛选

该试验中选用寒葱提取物为原料进行咀嚼片的制备，由于寒葱提取物经水提取，浓缩，干燥，其形态和成分发生了较大的改变，因此需要筛选适宜的填充剂种类及其比例。首先，选取乳糖和糊精进行复配作为填充剂使用，由表3可以看出，随着乳糖比例的减少，即糊精比例的增加，咀嚼片的硬度逐渐提高，但是在乳糖和糊精比例达到1∶1时，颗粒的休止角超过了30°，这说明乳糖的比例降低，所制得的颗粒流动性较差，在加工过程中，出现粘冲的现象。这是因为寒葱水提物本身有粘性，加上糊精的吸水性较好，在加工过程中，两者粘合性过强，导致片剂硬度过大，颗粒流动性较差。为了改善加工过程中粘冲的现象，调整糊精的比例，引入MCC进行3者复配。通过表3可以看出，由于糊精比例的下降，咀嚼片的硬度和颗粒的流动性都有了改善，但是在加工过程中，仍然存在有粘冲的现象，因此舍弃糊精，仅使用乳糖和MCC复配作为填充剂。调整乳糖和MCC比例时，咀嚼片的硬度为43.1～50.3 N，颗粒的休止角为30°以下，均在适宜的范围，但是随着乳糖比例的下降片剂的硬度有所提高，颗粒的流动性有所下降，因此，选取乳糖和MCC比例为2∶1作为适宜的填充剂复配比例来使用。

表3 寒葱咀嚼片填充剂种类和比例的筛选

2.2.2 寒葱提取物添加量的选择

寒葱水提物为黄褐色粉末，有较强的寒葱刺激性气味，且粘度较大，因此，寒葱提取物的添加量不宜过高。从表4中可以看出，随着寒葱提取物比例的升高，咀嚼片的硬度逐渐升高，在寒葱提取物用量为20%时，咀嚼片的硬度已经超出了适宜的范围，且出现了粘冲的现象。对咀嚼片进行感官评价结果，寒葱提取物添加量超过10%，其感官评分降低，因此，确定寒葱提取物适宜的添加量为10%。

表4 寒葱提取物添加量对咀嚼片品质的影响

2.2.3 甘露醇添加量的筛选

从表5可以看出，随着甘露醇添加量的增多，咀嚼片的硬度有所增加，但是都处于适宜的范围中，但是感官品质有差异。当甘露醇添加量为4%时，就达到了较好的矫味效果，感官评分达到最大值4.38，因此选取4%为甘露醇的适宜添加量。

通过试验，确定利用寒葱提取物制备咀嚼片的适宜配方为：寒葱提取物10%，乳糖57.3%，MCC 28.7%，甘露醇4%。

表5 甘露醇添加量对寒葱咀嚼片品质的影响

2.2.4 寒葱咀嚼片杀菌工艺的研究

该试验中选择对压片前的颗粒进行杀菌处理，再对处理后的颗粒进行压片操作，最后对所制得的咀嚼片进行微生物指标的测定。从表6中可以看出，在微波单独处理15 s的条件下，杀菌效果较差，使用紫外线长时间处理或者紫外线与微波复合处理，杀菌效果有了较大的提升，但是仍然没有得到很好的效果，菌落总数超过《GB16740-2014保健食品》中的限量要求。采用紫外线辐照与臭氧熏制复合处理，在无菌和自然条件下压片，菌落总数都<600 CFU/g，达到了理想的效果。在实验所得的咀嚼片中，均未检出大肠菌群。

表6 杀菌方法对寒葱咀嚼片杀菌效果的影响

2.2.5 寒葱咀嚼片的质量检查

按照中国药典的相关规定对咀嚼片进行质量和脆碎度的检查，所制得咀嚼片的片重差异为1.7%，小于药典规定的5.0%，检验结果为合格。经脆碎度测定处理后，咀嚼片失重为0.2%，小于药典规定的1%，没有检出断裂、龟裂及粉碎的片，不用进行复检，检验结果为合格。

2.3 寒葱咀嚼片肝保护辅助功能

2.3.1 寒葱咀嚼片对CCl4诱导的小鼠肝脏系数的影响

脏器重量的变化可作为粗略反映生物体器官是否正常或衰老程度的指标，肝脏重量的降低会直接影响动物的生长发育。由图2可知，模型组小鼠的肝脏系数极显著低于正常组，说明CCl4严重损伤了小鼠肝脏，但是经过寒葱咀嚼片灌胃处理的小鼠肝脏系数显著高于模型组，且与阳性组无显著差异。由此可以看出寒葱咀嚼片对急性肝损伤小鼠的肝脏组织具有保护作用，并且其效果相当于水飞蓟素。

注：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

2.3.2 寒葱咀嚼片对CCl4诱导的小鼠血清中转氨酶活性的影响

转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，其中ALT和AST是最常见的两种酶，而肝脏损伤往往表现为ALT和AST的活性异常[22]，导致血清中的活性升高。寒葱咀嚼片对小鼠血清中ALT和AST活性的影响如图3所示。模型组小鼠血清中的ALT和AST活性显著高于正常组，说明小鼠肝脏被CCl4损伤。而咀嚼片组血清中ALT和AST的活性显著低于模型组，可得出寒葱咀嚼片能够有效抑制被CCl4诱导的小鼠血清中ALT和AST活性。咀嚼片组小鼠血清中ALT的活性与阳性组无显著性差异，AST活性也与阳性组无显著差异，但略低于阳性组，证明寒葱咀嚼片对被CCl4诱导的小鼠血清中ALT和AST活性的抑制效果相当于水飞蓟素处理的效果。

2.3.3 寒葱咀嚼片对CCl4诱导的小鼠肝脏组织形态的影响

小鼠肝脏组织形态观察结果如图4所示，该结果显示，正常组小鼠肝脏边缘锐利、呈深红色、表面有光泽、质地柔软、富有弹性。模型组的小鼠肝脏出现弥漫性肿大的现象，肝脏质地较差，毫无弹性，表面粗糙，没有光泽，肝脏表面可见乳白色颗粒状物质，可能为坏死细胞。咀嚼片组与模型组相比，肝脏色泽变得更红，质地更加柔软，富有弹性，表面光滑，肝脏表面未见乳白色颗粒。通过图4-C、D可以看出，咀嚼片组小鼠的肝脏色泽、弹性、质地略优于阳性组，呈现出正常的暗红色光泽，其状态基本接近于正常组。

注：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

A：正常组；B：模型组；C：咀嚼片组；D：阳性组

2.3.4 寒葱咀嚼片对CCl4诱导的小鼠肝脏组织病理学的影响

小鼠肝脏经过固定、石蜡切片、HE染色等操作，最终在100、200、400倍光学显微镜下观察各组小鼠肝脏组织病理学。由图5可知，正常组中肝细胞界限明显，中央静脉周围的细胞呈放射状排列。而模型组中，肝细胞边界不清晰，中央静脉周围的细胞排列紊乱，出现典型的细胞凝聚现象。但是咀嚼片组肝细胞界限比较明显，中央静脉周围的细胞排列比较整齐，细胞凝聚现象得到明显改善，咀嚼片组的肝脏组织与正常组接近，说明小鼠肝损伤进程被寒葱咀嚼片所控制。

A：正常组；B：模型组；C：咀嚼片组；D：阳性组

3 讨论

CCl4急性肝损伤模型是经典的肝损伤模型，常被用来筛选具有肝保护作用的药物[23]。CCl4进入机体后，经肝脏细胞色素 P450代谢产生三氯甲基自由基和过氧三氯甲基自由基，破坏细胞膜结构，造成肝细胞脂质过氧化损伤。脂质过氧化损伤破坏肝细胞膜的完整性，从而导致肝细胞的AST和ALT释放入血，因此血清AST和ALT活性水平被认为是肝损伤最敏感的金指标，并被广泛应用于对急性肝损伤的诊断[24]。研究结果显示，寒葱咀嚼片灌胃剂量以3 g/kg·d连续灌胃30 d后，能显著降低被CCl4诱导的小鼠血清中AST和ALT的活性，说明寒葱咀嚼片能抑制细胞色素酶P450的活性，减少自由基的产生，减轻或阻断由于过氧化而引起的肝细胞膜、线粒体、溶酶体损伤导致的肝细胞坏死，从而达到降低转氨酶的效果。另外肝脏组织形态和病理学检查结果显示，寒葱咀嚼片能够显著缓解肝细胞变性坏死等病理性改变，说明寒葱咀嚼片对CCl4诱导的急性肝损伤具有显著的保护作用。

寒葱咀嚼片中主要活性物质来源是寒葱提取物，而葱属植物中大多含有丰富的黄酮类物质，而黄酮类物质具有清肝、抗菌、治疗急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化的作用。该实验中采用HPLC法对寒葱提取物中芦丁、槲皮素和山奈酚进行了分析，结果表明寒葱提取物中芦丁含量最高，其次为山奈酚，槲皮素含量最低。通过研究表明，芦丁、槲皮素和山奈酚对肝损伤小鼠具有一定的保护作用，其机制可能是黄酮类物质减少自由基的生成[25-27]。因此，寒葱咀嚼片对小鼠急性肝损伤的保护作用，可能主要来源于咀嚼片中的芦丁等黄酮类物质。

4 结论

以寒葱提取物为原料，通过湿法制粒法制备寒葱咀嚼片，其最佳制备工艺配方为：寒葱提取物10%，乳糖57.3%，MCC 28.7%，甘露醇4%；杀菌条件为：压片前对颗粒进行紫外线照射和臭氧处理各4 h。通过对小鼠的肝脏系数、血清中转氨酶活性、肝脏组织形态和病理学的观察，可以确认寒葱咀嚼片对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有很好的保护作用，有望开发成具有肝保护作用的保健产品。