HPLC法测定小花清风藤茎叶中两种三萜类化合物的含量

李曼姝 柯银铅 郭志勇 刘呈雄 邹 坤

(三峡大学 生物与制药学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002)

小花清风藤SabiaparvifloraWall. ex Roxb.为清风藤科清风藤属藤本植物，主要分布于云南、广西、贵州等地[1]．小花清风藤有抗病毒性肝炎的作用[2]，因其有着止痛、清热、消炎、祛风除湿的作用，在民间有“小黄药”、“黄眼药”、“黄肿药”的俗称[3]．据文献报道[4-11]，小花清风藤的主要化学成分为生物碱类、五环三萜类、黄酮类和苯丙素类等化合物．化合物1和化合物2为五环三萜类化合物，据文献报告，三萜类成分为小花清风藤的主要活性成分，有保肝作用[12]．为了给小花清风藤的资源开发及质量控制提供实验依据，本实验建立了高效液相色谱法测定小花清风藤茎叶中化合物1和化合物2质量分数的方法．

1 仪器与材料

1.1 仪器

Dionex Ultimate 3 000型高效液相色谱仪，美国戴安公司；Venusil XBP C18色谱柱(5 μm，250×4.6 mm分析型)；ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；乙腈为色谱纯，水为三蒸水，其它试剂均为分析纯．

1.2 材料

小花清风藤茎和叶采自贵州省黔西南布依族苗族自治州兴义市册亨县，其原植物标本于2017年2月采自同一地区，经三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室王玉兵博士鉴定为清风藤科(Sabiaceae)清风藤属(Sabia)小花清风藤(SabiaparvifloraWall. ex Roxb.)，植物标本现保存于本实验室(标本编号：201700227)．对照品：化合物1为自制，纯度≥95%；化合物2为自制，纯度≥95%．

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Venusil XBP C18(5 μm，250×4.6 mm)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：203 nm；柱温：30℃；其中测定化合物1的流动相为乙腈-水(90∶10)，测定化合物2的流动相为甲醇-水(83∶17)．

2.2 对照品溶液的配制

分别精密称取5.15 mg化合物1和4.00 mg化合物2，化合物1加入吡啶1 mL溶解，化合物2加入甲醇1 mL溶解，摇匀超声，均加甲醇定容至5 mL容量瓶中，分别制成质量浓度为1.030 0 mg/mL的化合物1储备液和0.800 0 mg/mL的化合物2储备液，所得对照品图谱见图1、2．

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 化合物1的供试品溶液的配制

取小花清风藤药材粉末(60目筛，50℃烘干)14.8 g，精密称定，加入75%甲醇200 mL，于60℃水浴，超声提取60 min，浓缩提取液，加甲醇定容至5 mL容量瓶中．取适量溶液离心(转速12 000 r/min)，沉淀15 min，上清液以0.45 μm的微孔滤膜滤过，取滤液即得．所得供试品图谱如图1所示．

图1 化合物1对照品、供试品色谱图

2.3.2 化合物2的供试品溶液的配制

取小花清风藤药材粉末(60目筛，50℃烘干)17.5 g，精密称定，加入75%甲醇200 mL，于60℃水浴，超声提取60 min，浓缩提取液，加甲醇定容至5 mL容量瓶中．取适量溶液离心(转速12 000 r/min)，沉淀15 min，上清液以0.45 μm的微孔滤膜滤过，取滤液即得．所得供试品图谱如图2所示．

图2 化合物2对照品、供试品色谱图

2.4 线性关系的考察

取化合物1和化合物2对照品储备液适量，用甲醇稀释，分别配制成质量浓度为0.257 5、0.515 0、0.669 5、0.772 5、1.030 0 mg/mL的化合物1系列标准溶液和质量浓度为0.400 0、0.480 0、0.600 0、0.680 0、0.800 0 mg/mL的化合物2系列标准溶液．按“2.1”项进行色谱分析．以峰面积(Y)为纵坐标，进样质量浓度(X, mg/mL)为横坐标，进行线性回归，得回归方程．化合物1为Y=119.53X-13.759，r=0.999 7(n=5)．结果表明化合物1进样量在0.257 5～1.030 0 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系．化合物2为Y=18.672X+0.879 3，r=0.999 6(n=5)．结果表明化合物2进样量在0.400 0～0.800 0 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系．具体见图3、4和表1、2．

图3 化合物1对照品线性标准曲线图

图4 化合物2对照品线性标准曲线图

表1 化合物1对照品线性关系考察

表2 化合物2对照品线性关系考察

2.5 精密度实验

分别准确吸取同一化合物1和化合物2对照品溶液20 μL，进样5次，峰面积平均值分别为109.766 0、15.647 0，峰面积积分值RSD(n=5)分别为1.09%和1.46%．

2.6 重复性实验

取小花清风藤粉末5份，按“2.3.1”项操作，制备5份化合物1的供试品溶液，按“2.3.2”项操作，制备5份化合物2的供试品溶液．再分别按“2.1项”色谱条件测定，测得化合物1的平均质量分数为0.092 13 mg/g，RSD为1.83%．化合物2的平均质量分数为0.347 1 mg/g，RSD为1.48%．

2.7 稳定性实验

分别取化合物1、化合物2供试品溶液进样，在2、4、8、12、24 h后分别进样20 μL，结果化合物1峰面积RSD为1.72%(n=5)，化合物2峰面积RSD为1.94%(n=5)，表明供试品溶液室温下放置24 h基本稳定．

2.8 加样回收实验

精密称定已知化合物1对照品质量分数的供试品5份，分别加入与样品质量分数相当的化合物1对照品，按“2.3.1”项方法进行样品处理．再精密称定已知化合物2对照品质量分数的供试品5份，分别加入与样品质量分数相当的化合物2对照品，按“2.3.2”项方法进行样品处理．再按照“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积，分别测定化合物1和化合物2质量分数，计算加样回收率．结果见表3、4．

表3 化合物1加样回收率测定结果

表4 化合物2加样回收率测定结果

2.9 样品含量测定

取3份小花清风藤粉末，每份约14.8 g，精密称定，按“2.3.1”项方法制备化合物1的供试品溶液，注入液相色谱仪，按照“2.1”项色谱条件测定峰面积．再取3份小花清风藤粉末，每份约17.5 g，精密称定，按“2.3.2”项方法制备化合物2的供试品溶液，注入液相色谱仪，按照“2.1”项色谱条件测定峰面积．计算样品中化合物1和化合物2的含量．结果见表5、6．

表5 化合物1样品测定结果

表6 化合物2样品测定结果

3 分析与讨论

1)实验结果表明，小花清风藤中化合物1的质量分数达到0.092 13 mg/g．采用色谱条件：乙睛-水(90∶10)；流速为：1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长为203 nm，化合物1与其他组分分离度好．小花清风藤中化合物2的质量分数达到0.347 1 mg/g．采用色谱条件：甲醇-水(83∶17)；流速为：1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长为203 nm，化合物2与其他组分分离度好．

2)该研究表明，HPLC测定小花清风藤中化合物1和化合物2的含量可行、稳定、简便、灵敏、准确，为清风藤科清风藤属小花清风藤药材的开发利用及质量控制提供一定的参考．