珍珠舌草胶囊全方对胃癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研究*

谭 宝，张 洁，冯五金，高丽萍，智雪峰，苏娟萍△

（1.山西省中医院，山西 太原 030000；2.山西医科大学第二医院，山西 太原 030000；3.山西中医药大学，山西 太原 030000）

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，全球每年新增确诊病例约 93.4万，位居所有恶性肿瘤的第2位[1]。胃癌是全球公认的高发病率的癌变疾病，虽然全球胃癌的发病率在下降，然而亚洲国家的胃癌致死率却仍在上升[2]，胃癌也是我国的高发疾病。研发高效、低毒的化疗新药和新的治疗方案对胃癌的治疗具有重要意义。

课题组根据传统中医理论及多年临床经验，研制出珍珠舌草胶囊，其由黄芪、枳实、白术、木香、砂仁、丹参、莪术、珍珠层粉、蒲公英、白花蛇舌草等组成，用于治疗胃癌前病变。经临床反复验证，累计治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）患者近万例，发现其在改善慢性萎缩性胃炎临床症状，降低胃黏膜慢性炎症、肠上皮化生、异型增生、Hp感染等方面作用显著[3-7]。慢性萎缩性胃炎伴癌前病变和胃癌关系密切，查阅文献发现，慢性萎缩性胃炎伴癌前病变和胃癌的病因病机、治疗方法有许多相同之处[8-10]。

珍珠舌草胶囊全方能有效治疗胃癌前病变，对胃癌可能有一定治疗效果，因此认为有必要针对珍珠舌草胶囊的抗肿瘤作用进行研究。珍珠舌草胶囊中的组成中药具有增强免疫力及抗肿瘤活性，应用珍珠舌草胶囊抗肿瘤研究具有现代药理学理论基础[11-14]。故本研究在珍珠舌草胶囊有效治疗慢性萎缩性胃炎伴癌前病变基础上，进一步探讨其抗肿瘤作用，以期为其临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、试剂与仪器 AGS细胞株购于中国科学院细胞库。Ham’s/F-12培养液购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程有限公司；DMSO（二甲基亚枫）和RNase A（核糖核酸酶A）购于金科宏达生物公司；MTT购于上海日初生物科技有限公司；PI（propidium iodide，碘化丙啶）购于美国Sigma公司；胰酶购于美国Invitrogen公司；33342/PI试剂盒购于中国Beyotime公司；Annexin V购于美国 BioVision公司；SpectraMAX 190微孔读板机购于美国分子仪器公司（MD，USA）；FACScan流式细胞仪购于美国BD公司（Becton Dickinson，USA）；ModFitLT V3.0 软件和荧光显微镜购于日本Olympus公司。

1.2 药物制备 珍珠舌草胶囊由黄芪、枳实、白术、木香、砂仁、丹参、莪术、珍珠层粉、蒲公英、白花蛇舌草等组成，药物由山西省中医药研究院中药房提供，生药鉴定由本研究中心完成并提供详实的鉴定报告。取珍珠舌草胶囊复方饮片1帖，加入8倍量95%乙醇浸泡12 h，武火煮沸后改用文火保持微沸2 h，过滤，滤渣重新加入约8倍95%乙醇，继续加热，重复提取2次，合并滤液，转移滤液至旋转蒸发仪，回收乙醇至不再蒸出，将提取物水浴挥干水分后转移至真空干燥箱减压低温干燥。待干燥后用研钵研成细粉备用。

1.3 胃癌AGS细胞培养 AGS细胞培养在含10%FBS、1%双抗的Ham’s/F12完全培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。视培养液颜色和细胞生长状况决定是否换液，当细胞贴壁达80%左右，用0.25%胰酶溶液消化传代。

1.4 细胞活力检测 AGS细胞以1.0×104个/mL接种于96孔板内，每孔200 μL，贴壁24 h后，换上含药培养基，以含DMSO培养基做阴性对照，珍珠舌草胶囊药物浓度为0.25、0.5、1.0 mg/mL，干预细胞生长24、48 h，然后加入 20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，继续孵育4 h，去除含MTT的培养液，加入150 μL DMSO，振荡 15 min，570 nm 处测定吸光值（OD），根据公式（药物组/对照组OD值）*100%计算细胞活力。

1.5 细胞周期检测 AGS细胞以2.5×104个/mL接种于6孔培养板，每孔3 mL，过夜待细胞贴壁后，将培养液换成不含血清的培养基，饥饿以同步，继续培养24 h后，换上不同浓度的含药培养基，珍珠舌草胶囊药物浓度为0.25、0.5、1.0 mg/mL，细胞分别培养24、48 h，0.25%的胰酶消化细胞，用预冷的PBS终止消化，吹打细胞，移入离心管中。弃上清，冷PBS洗2次，离心去PBS，加入1 mL PBS重悬细胞，加入预冷的无水乙醇固定，4℃，6 h以上。1 000 r/min离心5 min弃去固定液，2 mL冷PBS洗2次，离心后弃上清。4℃，PI染液染色，避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.6 细胞凋亡检测 AGS细胞以2.5×104个/mL接种于6孔培养板，每孔3 mL，贴壁24 h后，将培养液换成不含血清的培养基，饥饿以同步，继续培养24 h后，换上不同浓度的含药培养基，珍珠舌草胶囊药物浓度为 0.25、0.5、1.0 mg/mL，细胞培养 24、48 h，到作用时间后，收集细胞上清，加0.125%胰酶消化细胞，37℃约1 min，加细胞培养液终止消化，轻柔吹打细胞，并收集细胞与上清一起，切忌损伤细胞。冰冷PBS（4 mL）中离心，300×g，5 min，弃上清，旋涡振荡器点动分散细胞后，加入4 mL Annexin V结合缓冲液再次洗涤细胞，弃上清。加入500 μL Annexin V结合缓冲液重悬细胞，随后加入FITC标记的Annexin V 1 μL（终浓度 1 μg/mL），再次点动混匀，随后冰浴 30 min，中间取出再混匀一次。染色结束后，加入4 mL Annexin V结合缓冲液洗涤细胞，弃上清，加入500 μL Annexin V结合缓冲液重悬细胞，置于冰浴中保存。上机前加入PI（终浓度5 μg/mL），并立即上机检测。

1.7 Caspase-3活性检测 AGS细胞以2.5×104个/mL接种于6孔培养板，每孔3 mL，贴壁过夜，换上不同浓度的含药培养基，珍珠舌草胶囊药物浓度为0.25、0.5 mg/mL，细胞培养 24、48 h，0.25%胰酶消化，细胞数需达 1～5×106个，1 500 r/min，离心 5 min，悬浮细胞于50 μL冰冷细胞裂解液中裂解10 min，10 000×g离心1 min，收集上清，冰上放置，然后进行蛋白浓度测定，将50～200 μg蛋白用细胞裂解液补充至50 μL，加入 50 μL 的 2×反应缓冲液（含 10 mM DTT），加入5 μL 4 mM 的 DEVD-pNA（200 μM 终浓度），37 °C孵育1～2 h，405 nm处测定吸光值（OD）。

2 结果

2.1 珍珠舌草胶囊全方对AGS细胞活力的影响珍珠舌草胶囊干预胃癌细胞后，通过显微镜下观察，细胞数量明显减少，形态学也发生一定变化，部分细胞发生脱落、变圆，细胞壁边缘毛糙。从MTT结果可见，珍珠舌草胶囊干预胃癌细胞24、48 h，能呈剂量和时间依赖性的抑制AGS细胞生长。与DMSO对照组相比，0.25、0.5、1.0 mg/mL的珍珠舌草胶囊干预细胞24 h，可使AGS细胞活力从69.5%下降至14.5%；干预细胞48 h，可使AGS细胞活力从53.4%下降至9.26%，差异有统计学意义（P<0.01），见图1。

图1 珍珠舌草胶囊全方对AGS细胞活力的影响

2.2 珍珠舌草胶囊全方对AGS细胞周期的影响为了探讨珍珠舌草胶囊全方抑制胃癌细胞增殖的可能机制，检测了其干预胃癌细胞24、48 h后细胞周期的变化。结果表明，珍珠舌草胶囊全方能阻滞胃癌细胞周期于G2/M期，能显著增加处于G2/M期的细胞数，细胞数从16.29%上升至29.02%，而干预胃癌细胞 48 h，G2/M期的细胞数从 21.15%增加到37.67%。表明珍珠舌草胶囊全方干预细胞24、48 h均能阻滞胃癌细胞周期于G2/M期，见图2、图3。

2.3 珍珠舌草胶囊全方对AGS细胞凋亡的影响 细胞凋亡检测结果表明，珍珠舌草胶囊全方0.25、0.5、1.0 mg/mL干预胃癌细胞24 h后，早期凋亡率分别为3.4%、10.0%、16.1%，干预48 h后，早期凋亡率分别为5.4%、11.3%、20.2%，提示珍珠舌草胶囊全方促细胞凋亡有时间和剂量依赖性，与对照组相比，0.5、1.0 mg/mL组差异具有统计学意义（P<0.01），见图 4、图 5。

2.4 珍珠舌草胶囊全方对Caspase-3活性的影响 珍珠舌草胶囊全方干预AGS细胞24 h，0.25、0.5 mg/mL组Caspase-3的活性分别是对照组的2.56倍和3.69倍，干预48 h后，是对照组的2.73倍和7.32倍。提示珍珠舌草胶囊全方能呈时间和剂量依赖性地增加Caspase-3的活性，与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.01），见图 6。

图2 珍珠舌草胶囊全方对胃癌细胞周期的影响（24 h）

图3 珍珠舌草胶囊对胃癌细胞周期的影响（48 h）

图4 珍珠舌草胶囊全方醇提物对胃癌细胞早期凋亡的影响（24 h）

图5 珍珠舌草胶囊全方醇提物对胃癌细胞细胞凋亡的影响（48 h）

图6 珍珠舌草胶囊对Caspase-3活性的影响

3 讨论

本研究结果表明，珍珠舌草胶囊能够抑制胃癌细胞生长，阻滞胃癌细胞周期于G2/M期，促进细胞凋亡，明显增强Caspase-3的活性。细胞增殖与凋亡的平衡对于保持胃肠粘膜的完整性具有重要意义[15-16]。一旦这种平衡被破坏，就会诱发慢性萎缩性胃炎或胃癌前病变甚至是肿瘤。慢性萎缩性胃炎伴癌前病变是胃癌的重要诱发因素，因为重症胃炎破坏了胃粘膜的上皮细胞，最终正常的胃粘膜上皮细胞被具有较高增殖率的肠上皮细胞和异型增生细胞取代，导致了慢性肠化生和异型增生的出现。肠化生和异型增生打破了正常胃粘膜细胞增殖与凋亡的平衡，增加了胃癌的发生机率[17]。目前缺乏治疗胃癌伴癌前病变的有效药物，而中医药治疗该病取得了较好的临床效果。

珍珠舌草胶囊为临床经验方，可以有效治疗慢性萎缩性胃炎伴癌前病变，对胃癌前病变细胞的增殖有良好的阻断作用。周期阻滞和诱导凋亡是抑制细胞生长的两个重要因素[18-19]。死亡受体和线粒体依赖途径是细胞凋亡的主要途径[20]。Caspase-3是这两条途径的一个主要环节，因此它在细胞凋亡中起到非常重要的作用。细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程，肿瘤的形成一方面是增殖分化异常，分化不良增殖过度，另一方面是诱导凋亡的基因突变，抑制凋亡的基因过度表达使得凋亡不足[21]。珍珠舌草胶囊全方干预AGS细胞24、48 h后，Caspase-3的活性均明显升高，并且作用呈现出一定的时间和剂量依赖性。提示珍珠舌草胶囊促进AGS细胞凋亡，可能与其增强了Caspase-3的活性有关。

分析以上结果可知，珍珠舌草胶囊全方能够抑制ACS细胞生长，其抑制细胞增殖的作用可能与阻滞细胞周期，促进胃癌细胞凋亡有关，而促凋亡作用可能通过升高Caspase-3的活性实现。上述结果说明，珍珠舌草胶囊在体外实验中具有一定的抗肿瘤活性，下一步将进行拆方研究，进一步明确抗肿瘤有效成分，为临床更好地应用珍珠舌草胶囊提供理论和实验依据。