儿童支气管哮喘血清1,25二羟维生素D3水平与支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6含量的关系

刘晓丽，丁亚星，刘晓方

（1.荥阳市妇幼保健院 检验科，河南 郑州 450000；2.荥阳市人民医院 检验科，河南 郑州 450000）

支气管哮喘发病涉及多种呼吸道细胞和因子，是一种呼吸道感染和气流受阻的慢性疾病，其患病机制主要是呼吸道炎症和重塑，有易犯病、易反复、病程长等特征［1-2］。处于婴幼儿期的儿童支气管哮喘发病率较高，严重威胁其身心健康，若未得到及时治疗，甚至可能成为终身疾病。哮喘患儿均存在维生素D 缺乏以及不足情况，这种维生素D 缺乏以及不足状态不仅导致患者体内钙磷代谢异常，还会影响患者体内免疫应答与炎症反应调节［3］。1,25-(OH)2D3是合成25-(OH)D3前体，是维生素D 在体内循环的主要形式［4］。研究显示，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子均参与并介导支气管哮喘气道重塑以及炎症发生过程。肺泡灌洗液直接来自于患儿病变发生部位，该部位MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 水平可以直接反映出患儿支气管哮喘所致炎症情况［5］。本研究旨在探究儿童支气管哮喘血清1,25-(OH)2D3水平与肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

回顾性分析荥阳市妇幼保健院2015 年12 月至2016 年11 月儿童支气管哮喘66 例患儿的临床资料，作为观察组，根据哮喘病情分成轻度20例、中度22 例和重度24 例；并收集同时期就诊的30 例非哮喘患儿资料作为对照组。轻度患儿中男10 例，女10 例；年龄6 个月至9 岁，平均（5.2±0.34） 岁；病 程4 个 月 至7 年，平 均（4.13±0.59）年；体质量指数12～17 kg/m2，平均（14.36±0.52）kg/m2。中度患儿中男10 例，女12例；年龄7 个月至8 岁，平均（5.36±0.41）岁；病程5 个月至7 年，平均（4.24±0.73）年；体质量指数12～18 kg/m2，平均（14.36±0.41） kg/m2。重度患儿中男12 例，女12 例；年龄6 个月至8岁，平均（5.29±1.56）岁；病程5 个月至7 年，平均（4.31±0.22）年；体质量指数11～18 kg/m2，平均（14.34±042）kg/m2。三组患儿在男女比例、年龄和体质量指数等一般资料方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。纳入标准：①儿童支气管哮喘诊断遵循《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》［6］相关标准；②入院就诊时进行详细的基本检查；③家属对本研究知情且签署同意书。排除标准：①有明显呼吸道感染患儿；②免疫缺陷、肾功能不全、甲状腺疾病患儿；③近期服用维生素D 的患儿。

对照组30 例非哮喘患儿中，男17 例，女13例；年龄8 个月至9 岁，平均（5.32±0.57）岁；病程5 个月至7 年，平均（4.43±0.35）年，体质量指数11～17 kg/m2，平均（14.46±0.35）kg/m2。纳入标准：①呼吸道畸形或支气管异物患儿；②家属知晓本研究且签署同意书。排除标准：①近期有感染史或肝肾功能不足者；②免疫缺陷或过敏患儿。观察组与对照组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 研究对象均抽取静脉抗凝血4 mL，室温放置2 h，于2 000 r/min 速度下离心15 min，将血清封存于-70℃冷藏待测。哮喘组在支气管镜检查后灌洗支气管肺泡，灌洗部位选取右肺中叶；对照组取右肺中叶或非异物侧肺进行灌洗。当上述部位被支气管镜嵌入时，将无菌盐水（浓度9 g/L，37℃）通过支气管镜吸引孔注入灌洗部位开始灌洗；患儿体重小于20 kg 时，灌洗量为5～10 mL/次，共2 次；患儿体重大于20 kg者，灌洗量为10 mL/次，共2 次；灌洗后在负压100～150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）下抽吸，手术操作时间0.25～0.50 h。所有灌洗液混匀，1 500 r/min速度4℃冷冻离心10 min，上清液冷藏封存于-70℃待测，沉淀物用于细胞分析。

1.2.2 各项指标检测 细胞计数：使用计数池法对所得肺泡灌洗液沉淀物进行细胞计数，数据表示为×109/L，用于细胞分类计数涂片制备好后采用瑞氏染色法染色，涂片计数时700 个细胞/涂片，结果取3 张涂片平均值。

因子检测：血清1,25-二羟基维生素D3［1,25-(OH)2D3］水平及支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 水平均采用酶联免疫吸附法检测，所有因子检测步骤均严格按照试剂盒上的说明书操作，且由专人操作完成。

1.3 观察指标

①比较两组患儿血清1,25-(OH)2D3水平和肺泡灌洗液中MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量水平；②比较哮喘发作程度不同患儿血清中1,25-(OH)2D3水平和支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量；③分析支气管哮喘患儿血清1,25-(OH)2D3水平和支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量水平相关性；④患儿支气管肺泡灌洗液细胞总数及巨噬细胞和炎症细胞分类计数。

1.4 统计学方法

数据处理采用SPSS 19.0 软件包处理。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，随后应用SNK 检验进行两两比较。计数资料用百分率（%）显示，使用χ2检验。使用Pearson 进行相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清1，25-(OH)2D3 水平和肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量比较

观察组血清1,25-(OH)2D3水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；而观察组患儿血清MMP-9、TNF-α、TGF-β1 和IL-6 水平则高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 不同程度哮喘患儿血清1，25-(OH)2D3 水平和支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量比较

不同程度哮喘患儿血清1,25-(OH)2D3水平之间关系为轻度哮喘>中度哮喘>重度哮喘，两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；而MMP-9、TNF-α、TGF-β1 和IL-6 水平之间变化趋势则为重度哮喘>中度哮喘>轻度哮喘，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 两组血清1，25-(OH)2D3水平和肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量比较 （）

表1 两组血清1，25-(OH)2D3水平和肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量比较 （）

表2 不同程度哮喘患儿血清1，25-(OH)2D3水平和支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量比较 （）

表2 不同程度哮喘患儿血清1，25-(OH)2D3水平和支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量比较 （）

注：1）与轻度哮喘组比较，P<0.05；2）与中度哮喘组比较，P<0.05。

2.3 支气管哮喘患儿血清1，25-(OH)2D3 水平和肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量水平相关性分析

由相关性分析可知，哮喘患儿支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 水平与血清中1,25-(OH)2D3之间的关系均呈负相关，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 哮喘患儿血清1，25-(OH)2D3水平和支气管肺泡灌洗液MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 含量相关性分析

2.4 两组支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞及炎症细胞分类计数

观察组支气管肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和上皮细胞计数多于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组巨噬细胞计数少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 两组支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞及炎症细胞分类计数 （）

表4 两组支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞及炎症细胞分类计数 （）

3 讨论

支气管哮喘为呼吸内科常见的慢性炎症疾病，其发病率在我国极高，尤其在4～5 岁儿童时期极易发病，具有患病时间长、易反复等特点，患有该病的儿童临床症状为反复发作喘息、哮喘或胸闷等，严重威胁儿童的身心健康［7］。研究显示［8］体内外异物可以从呼吸道或肺循环进入肺部，肺部存在由炎症介质及细胞因子相互作用构成的复杂网络，刺激气管结构细胞或炎症细胞分泌各类促炎因子，从而诱发哮喘。

近年来有研究发现［9］，体内维生素D 水平缺乏可能导致支气管哮喘、肺结核等肺部疾病，维生素D 不仅可以调控体内钙、磷代谢，还具有抵抗病毒感染，调节免疫反应，缓解呼吸道重塑等功能。1,25-(OH)2D3是维生素D生物活性代谢产物，可以调节血清及骨骼中钙磷代谢，使其保持平衡［10］。研究发现［11］，1,25-(OH)2D3与其相关受体VDR 结合可发挥相应的生物学效应；而VDR 基因与呼吸道类疾病关系密切，并可以调控机体免疫反应、控制气道炎症。孕妇摄入越多维生素D，胎儿出生后患哮喘的概率越低［12］。本研究结果显示，非哮喘患儿血清中1,25-(OH)2D3水平显著高于哮喘患儿（P<0.05），哮喘发病程度越轻，血清中1,25-(OH)2D3水平越高。蒋文良［13］的研究结果同样显示血清中维生素D 水平与肺部功能呈正相关，补充维生素D 可辅助治疗支气管哮喘。

MMP-9 由于可以降解细胞外基质，因此被认为与哮喘气道重塑存在关系，是导致气道重塑的关键原因［14］。支气管哮喘发作时，巨噬细胞被活化，分泌出大量的TNF-α、IL-6 等炎性因子，诱导中性粒细胞浸润，致使支气管痉挛［15］。本研究中，哮喘患儿肺泡灌洗液中MMP-9、TNF-α、TGF-β1和IL-6 显著高于非哮喘患儿，其水平随病情加重逐渐上升；哮喘患儿灌洗液中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和上皮细胞显著多于非哮喘患儿，而巨噬细胞数显著少于非哮喘患儿。WALTERS等［16］认为正常状态下肺组织无MMP-9 存在，当患有支气管哮喘时，调控MMP-9 基因表达因子被激活，致使包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞聚集，释放出TNF-α 等因子加快了MMP-9 合成与活化，因而引起哮喘气道平滑肌组织MMP-9的表达上调，免疫功能受损，巨噬细胞减少，炎症细胞增多，TNF-α、TGF-β1 和IL-6 等炎症因子水平也增高。

综上所述，支气管哮喘患儿血清中1,25-(OH)2D3水平明显降低，支气管肺泡灌洗液中MMP-9、TNF-α、TGF-β1、IL-6 水平上升，这种变化趋势对儿童支气管哮喘的治疗具有重要的指导意义。