血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1联合检测用于早期甲状腺乳头状癌的诊断

程燕 何启胜

池州市人民医院内分泌科 247000

微小RNA(miRNA)是不编码蛋白质的RNA。人血液中的miRNA非常稳定，对内源性RNA酶不敏感[1]。从肿瘤细胞释放到体液的miRNA及其细胞内miRNA是诊断癌症的潜在生物标志物。最近的研究分析了不同类型甲状腺肿瘤组织中miRNA的表达，结果表明，甲状腺乳头状癌(PTC)患者血清miR-451a、miR-25-3p、生长阻滞特异性因子8反义RNA 1(the growth arrest-specific 8-antisense RNA 1,GAS8-AS1)的表达与非肿瘤组织或良性增生性多结节性甲状腺组织有显著差异[2-3]。目前临床常用甲状腺球蛋白(Tg)作为甲状腺癌血液指标的参考。故本研究以Tg作为参考，探讨血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1联合检测对早期PTC诊断的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入2016年3月至2019年3月池州市人民医院内分泌科收治的早期PTC患者70例为肿瘤组；其中男33例，女37例，年龄33～72岁，平均年龄(46.13±12.09)岁；肿瘤直径1.1～3.5 cm，平均直径为(1.89±0.92)cm；依据国际抗癌联盟《TNM恶性肿瘤分类》第7版进行TNM分期：Ⅰ期48例，Ⅱ期22例。同时纳入池州市人民医院内分泌科院收治的甲状腺良性结节患者70例为良性组；其中，男34例，女36例，年龄31～82岁，平均年龄(43.50±18.38)岁。肿瘤组和良性组均经池州市人民医院病理科证实。排除标准：(1)严重心、肝、肾功能损害者。(2)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者。(3)患有精神疾病者。(4)患有其他肿瘤者。同时，纳入2016年3月至2019年3月于池州市人民医院体检的健康体检者70名为对照组；其中男35名，女35名，年龄39～77岁，平均年龄(45.28±16.28)岁。各组一般资料比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，可纳入此次分析。本研究经医院伦理委员会审批(IEC-FOM-013-20)，受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法 采集治疗前肿瘤组、治疗前良性组和对照组的肘前静脉血5 ml。使用武汉艾美捷科技有限公司的Tg检测试剂盒(货号：KA4022)。

使用RNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，RP5301)抽取总RNA。miR-451a、 miR-25-3p、 GAS8-AS1的引物通过NCBI在线设计，见表1，交由武汉金凯瑞公司合成。以U48作为内参。3个指标为同一批样本分批检测，去除极大值和极小值，保留其余数据。

表1 引物序列和名称

2 结果

2.1 3组血清中miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1、Tg的表达水平 肿瘤组、良性组和对照组血清中miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1、Tg的表达水平差异存在统计学意义(P均<0.05)，见表2。

2.2 肿瘤组和对照组血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的ROC曲线、AUC、敏感性、特异性和截断值 为了评估血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1在肿瘤组和对照组中的诊断价值，绘制肿瘤组和对照组的ROC曲线。miR-451a的ROC曲线AUC为0.89±0.05(95%CI: 0.804 7～0.988 7，P<0.000 1)，以miR-451a的阳性临界值为0.330 4，其诊断敏感性为86%，特异性为93%；GAS8-AS1的ROC曲线AUC为0.84±0.05(95%CI: 0.734 6～0.947 6，P<0.000 1)，以GAS8-AS1的阳性临界值为0.712 3，其诊断敏感性为83%，特异性为83%；miR-25-3p的ROC曲线AUC为0.84±0.06(95%CI： 0.737 3～0.958 2，P<0.000 1)，以miR-25-3p的阳性临界值为0.908 9，其诊断敏感性为87%，特异性为87%。Tg的ROC曲线AUC为0.81±0.04(95%CI： 0.728 3～0.882 8，P<0.000 1)，以Tg的阳性临界值为12.87(μg/L)，其诊断敏感性为83%，特异性为73%，见图1(封3)。

表2 3组血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1的表达水平比较

2.3 肿瘤组和良性组血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的ROC曲线、AUC、敏感性、特异性和截断值 为了评估血清中miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1在肿瘤组和对照组中的诊断价值，绘制肿瘤组和对照组的ROC曲线。miR-451a的ROC曲线AUC为0.85±0.06(95%CI: 0.736 5～0.974 6，P<0.000 1)，以miR-451a的阳性临界值为1.029，其诊断敏感性为97%，特异性为87%；GAS8-AS1的ROC的AUC为0.86±0.06(95%CI: 0.75～0.97，P<0.000 1)，以GAS8-AS1的阳性临界值为0.713 5，其诊断敏感性为97%，特异性为80%；miR-25-3p的ROC曲线AUC为0.84±0.05(95%CI：0.748 5～0.947 0，P<0.000 1)，以miR-25-3p的阳性临界值为1.046，其诊断敏感性为78%，特异性为93%。Tg的ROC曲线AUC为0.81±0.04(95%CI： 0.729 7～0.886 0，P<0.000 1)，以Tg的阳性临界值为12.54(μg/L)，其诊断敏感性为84%，特异性为71%，见图2(封3)、表4。

2.4 血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1联合诊断早期PTC 患有早期PTC为真阳性，未患有早期PTC为真阴性。因Tg的敏感性和特异性较低，故采用血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的联合诊断。以miR-451a的阳性临界值为1.029，GAS8-AS1的阳性临界值为0.723， miR-25-3p的阳性临界值为1.046为诊断标准，三者均满足为联合诊断阳性，反之则为联合诊断阴性。血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1联合对早期PTC诊断的敏感性为94.29%(66/70)，特异性为88.57%(124/140)，准确性为90.48%(190/210)，见表3。

表3 血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1联合诊断早期甲状腺乳头状癌

3 讨论

目前，患有可疑甲状腺结节的患者通常通过超声、CT进行检查。随后，通过术前超声引导细针穿刺细胞学检查和术中病理检查冷冻切片检查可疑PTC患者[4]。术前超声引导细针穿刺细胞学检查采样不足会导致细胞学诊断失败，可能需要反复抽吸[5]。由于其侵入性，重复抽吸对PTC患者可能是危险的。迫切需要一种新的生物标志物来区分临床上的恶性甲状腺病变和良性甲状腺病变。本研究发现血清miR-451a、 miR-25-3p、 GAS8-AS1联合对早期PTC诊断的敏感性为94.29%，特异性为88.57%，准确性为90.48%。血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1单项诊断的敏感性和特异性均高于Tg。

以往的研究表明，甲状腺组织中miR-451表达上调与PTC淋巴转移有关，而甲状腺未分化癌细胞中miR-25的异位表达，通过诱导细胞周期阻滞来抑制癌细胞的增殖[6-7]。miR-451a是不同前体产生高度相似成熟miR-451的一种miRNA，miR-25-3p来源于前体miR-25 3′端茎环臂的miRNA。本研究发现，肿瘤组血清miR-451a、miR-25-3p的表达水平均高于良性组和对照组(P均<0.05)。miR-451a、miR-25-3p鉴别肿瘤组与对照组敏感性分别为86%、87%，特异性分别为93%、87%，鉴别肿瘤组与良性组的敏感性分别为97%、78%，特异性分别为87%、93%。先前的研究发现，miR-25的高表达能够抑制癌细胞的增殖[7]。PTC患者血清中miR-25的高表达可能是机体对PTC的自我调节。众所周知，循环miRNA是肿瘤细胞死亡和裂解的产物，由肿瘤来源的微泡或外泌体释放，可能来自癌症相关的免疫反应[8]。因此，PTC可以释放更高水平的血浆miR-25-3p和miR-451a。

据报道，在PTC中，GAS8-AS1 c.713A>G/714T>C的核苷酸改变导致其RNA表达的显著降低[9]。同时，与甲状腺癌旁组织相比，没有突变的PTC组织中也观察到GAS8-AS1水平降低，因此GAS8-AS1的表达水平与PTC的发生、发展相关，提示其可成为潜在的PTC生物标志物。本研究发现，肿瘤组GAS8-AS1的表达水平低于良性组和对照组(P<0.05)。GAS8-AS1鉴别肿瘤组与对照组的敏感性和特异性均为83%。GAS8-AS1鉴别肿瘤组与良性组敏感性和特异性分别为97%和80%。异位表达的GAS8-AS1显著抑制多种甲状腺癌细胞系的细胞活力，而内源性GAS8-AS1表达的降低可促进PTC细胞的增殖，提示GAS8-AS1是一个潜在的抑癌基因[10-11]。

本研究存在局限性，未对血清miR-25-3p、miR-451a和GAS8-AS1水平与临床病理特征之间的潜在关系进行详细分析，因为样本量较小，难以进行分层和缺乏对这些miRNA的功能研究。因此，需要在更大群体中进一步研究，以评估血清miR-25-3p、miR-451a和GAS8-AS1水平作为PTC术前诊断以及预测肿瘤复发的生物标志物的价值。

综上所述，血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的联合检测可作为诊断早期PTC的潜在标志。