青蒿琥酯对子宫内膜癌细胞凋亡及PARP-1蛋白的影响

刘洋，杨秀梅，邵迎华，韩哲，孙广宇

子宫内膜癌是绝经期女性好发的恶性肿瘤疾病，属于生殖系统疾病，临床表现为阴道无规律出血及疼痛等[1]。目前，通过对患者进行病理和腹腔镜磁共振显像确定病灶情况，进一步确定手术方案。子宫内膜癌早期不易发现，晚期患者需要进行放化疗，预后不佳。寻找科学、有效的药物改善子宫内膜癌疾病至关重要[2]。

聚ADP核糖聚合酶-1 (PARP-1)是一种多功能的核酶，存在于真核细胞的细胞核内，PARP-1不同基因位置功能不同，大量研究显示，PARP-1与乳腺癌、卵巢癌的发展相关[3]。子宫内膜癌治疗的难点在于癌细胞能够转移、扩散，所以，抑制癌细胞血管新生及促进癌细胞凋亡已经成为治疗子宫内膜癌的途径之一。青蒿琥酯(Art)属于中药提取的衍生物，临床多用于重度和脑部疟疾[4-5]，但是对子宫内膜癌细胞生物活性及PARP-1水平的影响，目前文献报道较少，现探讨青蒿琥酯对子宫内膜癌细胞凋亡及PARP-1蛋白的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1) 细胞：子宫内膜癌HEC1B细胞株(上海柯丰生物科技有限公司)；(2)药物、试剂：青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司)； MTT、DMSO(USA Sigma公司)；PARP-1(上海再鼎医药有限公司)；(3)仪器：Tanswell小室(北京优尼康生物科技有限公司)；蛋白质电泳仪(河北慧采生物有限公司)；RPMI1640培养基(上海朗顿生物技术有限公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；流式细胞仪(USA BD Biosciences)。

1.2 HEC1B细胞株培养与分组 2019年5—9月于沧州市人民医院实验室完成。将低温冷藏的HEC1B细胞株，快速移入37℃水中溶解，离心弃除上清液，加入培养基，无氧下培养，每隔一日更换培养液，细胞生长至85%～90%时消化传代。HEC1B细胞株分为对照组、药物组，药物组以加入不同浓度青蒿琥酯再分为25 mol/L、50 mol/L和100 mol/L 3个亚组。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 MTT法检测HEC1B细胞株活性：将浓度为1 000 ng/μl的青蒿琥酯溶液采用10%FBS分别调整浓度为25 mol/L、50 mol/L和100 mol/L，取HEC1B细胞1×107/ml接种到96孔板中，对照组正常培养，药物组加入25 mol/L、50 mol/L和100 mol/L青蒿琥酯溶液，分别培养24 h、48 h及72 h，后加MTT 20 μl，4 h后，加入DMSO 150 μl，采用酶标仪于570 nm波长处检测每个孔HEC1B细胞的活性(OD值)。

1.3.2 Transwell法测定HEC1B细胞株迁移能力：将各组HEC1B细胞株进行饥饿处理，12 h后再加入DMSO，24 h后离心重悬细胞1×107/ml， 将细胞悬液200 ml加入小室中，下室中档为400 μl的培养架，37.5℃培养2～3 d，取出小室，用棉签拭去上室细胞，进行染色，计算HEC1B细胞株数。

1.3.3 流式细胞仪检测HEC1B细胞凋亡：将各组HEC1B细胞株以1×107/ml置于96孔板，培养1 d后，加入少量胰蛋白酶，消化4 h后，用-20℃的医用酒精固定，离心后，采用PBS清洗多次，每次5 min，进行遮光染色，分析HEC1B细胞凋亡。

1.3.4 免疫印迹法检测PARP-1蛋白： 取各组浓度为1×107/ml的HEC1B细胞溶液100 μl，高速离心0.5 h，收集上清液。在蛋白上清液中加入样孔。电泳后，取下PVDF膜TBS浸泡10 min，密封，采用PBS清洗3次，每次5 min，然后加一抗(1∶500),40℃杂交1 d，采用PBS清洗3次，每次5 min，加过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，杂交2 h，再次冲洗。将膜浸入ECL工作液，随后进行检测，获取图像。

2 结 果

2.1 各组HEC1B细胞OD值比较 干预后，不同时点各组内OD值比较差异无统计学意义(P均>0.05)；相同时间点对照组OD值高于各药物浓度亚组(P均<0.05)，随着青蒿琥酯浓度增加，HEC1B细胞OD值依次降低(P均<0.05)， 见表1。

2.2 各组HEC1B细胞侵袭能力比较 干预后，对照组及25 mol/L、50 mol/L、100 mol/L亚组细胞侵袭数目依次减少，分别为322.00±36.50、211.00±19.55、169.20±12.48及54.69±16.53，差异有统计学意义(F=113.800，P=0.001)，见图1。

2.3 各组HEC1B细胞凋亡情况比较 干预后，对照组G0-1期HEC1B细胞凋亡数最少，随着青蒿琥酯浓度的增加，细胞凋亡数依次增加；对照组S期及G2-M期细胞凋亡数高于药物组，随着青蒿琥酯浓度增加，细胞凋亡数依次减少(P<0.05)；药物组凋亡率高于对照组，随着青蒿琥酯浓度的升高，HEC1B细胞凋亡率依次升高(P<0.05)，见表2。

2.4 各组HEC1B细胞PARP-1蛋白表达水平比较 干预后，对照组及25 mol/L、50 mol/L、100 mol/L亚组 HEC1B细胞中PARP-1蛋白水平依次降低，分别为(86.54±5.36)、(65.89±3.65)、(55.12±2.78)和(43.15±1.96)，差异有统计学意义(F=126.600，P<0.001)，见图2。

注：A.对照组，B.25 mol/L亚组，C.50 mol/L亚组， D.100 mol/L亚组

3 讨 论

子宫内膜癌是女性生殖系统高发恶性疾病，据最新报道显示，每年有近20万新增患者，该病已经成为导致女性死亡率升高的第三大疾病[6]。多项研究显示，对子宫内膜癌患者进行及时治疗5年生存率较好，导致疾病发生、发展的原因与抑癌基因失活相关。大量研究显示，当机体细胞处于正常水平时，细胞内PARP-1处于未激活状态。但是当机体发生癌变时，细胞DNA损伤，PARP-1被激活，加重病情[2]。本研究通过对HEC1B细胞进行青蒿琥酯干预，观察子宫内膜癌细胞生物活性及其PARP-1表达水平。

青蒿琥酯属于天然化合物，于菊科植物黄花蒿中提取，属于抗重度疟疾药物，并获临床批准用药，与其他药物相比，青蒿琥酯属于中成药物，不良反应少[7-8]。近些年，青蒿琥酯逐渐用于治疗恶性肿瘤，其对多种恶性肿瘤细胞均有抑制作用，表明该药物可以作为新型抗癌药物。本研究结果表明，青蒿琥酯对HEC1B细胞活性具有抑制作用，随着青蒿琥酯浓度的增加OD值不断减少，活性降低,且青蒿琥酯能够诱导HEC1B细胞凋亡，减少向外侵袭。大量文献表明，癌症细胞核酸代谢较强，需要多种物质参与代谢，例如高密度的铁蛋白等。青蒿琥酯对子宫内膜癌活性抑制作用在于能够导致癌细胞在铁离子的诱导下，发生分解，并产生大量自由基[9]。有关研究显示，青蒿琥酯能够加强子宫内膜癌细胞凋亡，机制在于对细胞膜及基因进行干预，促进子宫内膜癌细胞凋亡[8，10]。Li等[11]研究表明，青蒿琥酯能够使子宫内膜癌细胞停滞在前期，S期凋亡细胞显著降低，并与药物浓度成正比，与本研究结果相似。

图1 各组HEC1B细胞侵袭数目比较

表1 各组HEC1B细胞活性OD值比较

表2 青蒿琥酯对HEC1B细胞周期及凋亡率的影响

本结果表明，青蒿琥酯能够降低PARP-1蛋白水平，且随着青蒿琥酯浓度的升高，PARP-1蛋白表达水平逐渐降低。PARP-1能够在癌细胞内释放，延长癌细胞基因修复，导致癌细胞存活时间延长[12-13]。但是当PARP-1失活时，无法对癌细胞基因进行修复，使癌细胞凋亡停滞，细胞活性受到抑制，启动凋亡机制[14]。姜淑娟等[15]研究发现，子宫内膜癌患者细胞PARP-1大量表达，病情加重。PARP-1能够作为评判子宫内膜癌患者病情的主要指标之一，在临床上针对PARP-1治疗已经成为研究热点[16]。Li等[17]研究发现，青蒿琥酯能够抑制卵巢癌细胞活性，降低PARP-1水平，诱发癌细胞凋亡。这与本结果相似。Moses等[18]研究发现，青蒿琥酯能够抑制子宫内膜癌细胞繁殖，抑制血管新生，这与抑制PARP-1水平具有直接关联，具体作用机制还需要进一步研究。

综上所述，青蒿琥酯能够抑制HEC1B细胞株增殖，减少向外侵袭的能力，加快凋亡，其作用机制可能与减少细胞中PARP-1表达有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘洋、杨秀梅:提出选题及研究方向，设计实验方案并实施，论文撰写；邵迎华、韩哲：补充研究内容，辅助修改论文；孙广宇：对数据进行统计学分析，论文终审