猪肺炎支原体山西株的分离与鉴定

张欣荣，岳伟东，张警文，任高雅，孙 铮，岳美杉，刘怡慧，范小瑞，贺俊平

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）

猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumonia ofswine，MPS）俗称猪气喘病[1]，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的慢性消耗性呼吸道传染病。猪被感染后呼吸系统免疫力下降，会继发感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）或猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）[2]，猪的出栏率、生长率和饲料转化率降低，大大影响养猪业的经济效益。目前，主要通过饲料饮水添加抗生素来控制猪肺炎支原体对呼吸道的感染，但抗生素使用不当会使多种病原产生耐药性，同时会存在兽药残留问题，导致猪肉品质降低[3]。病猪康复后可以产生自身免疫保护力，提示治疗MPS 有效的措施是注射疫苗[4]，但目前国内市场上的灭活疫苗均是进口疫苗，其与山西地方病原存在差异，而且灭活疫苗以体液免疫为主，免疫效力较低，需多次注射才能产生预期的保护效果[5]，而多次注射又会增加养猪业的经济成本，免疫所产生的经济效益还需考虑[6]。国产疫苗168 弱毒苗“支必宁”使用范围最广，但其对一些支原体敏感的猪品种不适用[7]，因为其原始菌株来自太湖猪中的二脸花猪，可能存在地域局限并不适用于对北方地方菌株的治疗。Mhp 在全国各地区均为高感染率，而山西地区感染较为严重。在对新疆北部地区16 个规模化猪场的456 份猪血清样品中检测出Mhp 抗体阳性率为50.4%，感染阳性率为68.75%[8]。对山东地区猪支原体流行性调查发现，该地区Mhp 抗体检测阳性率为56.48%[9]。对山西境内非免疫猪群抽检发现，猪肺炎支原体血清抗体阳性率为36.5%以上[10]，在山西省太原和晋中2 个区域7 个200 头基础母猪规模以上的猪场，发现各猪场母猪血清阳性率高达100%[11]。Mhp 有组织嗜性，能在活体猪肺中长期滞留，难以根除[12]。目前，缺乏山西猪肺炎支原体地方株有效菌株信息和相关病原学研究。

本研究对猪肺炎支原体山西地方株进行分离与鉴定，在晋中市进行流行病学调查，并采集病料，从采集到具有典型病理特征的肺脏中分离出猪肺炎支原体山西地方株，以期补充猪肺炎支原体山西地方株的菌株信息，同时为后续相关研究提供物质基础和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 2019 年在晋中市各猪场进行流行病学调查，并进行PCR 鉴定。随机抽取出现咳嗽、气喘、腹式呼吸等典型猪支原体肺炎临床症状的猪，病理解剖呈“虾肉样”、“胰样”，经 PCR 鉴定患有猪支原体肺炎的猪肺脏，其中，一部分放到Bouin's 液中固定，一部分放入液氮中保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 猪肺炎支原体168 活疫苗（乾元浩生物股份有限公司），KM2 培养基（江苏省农业科学院），支原体固体平板培养基及辅助液（北京中海生物科技有限公司），细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司），2×PCR Mix（康为世纪生物科技有限公司）和DNA Marker（中科瑞泰（北京）生物科技有限公司），孔径为0.22 μm和 0.45 μm 的滤菌器（美国 Millipore），瑞氏染色液（北京索莱宝科技有限公司），组织基因组提取试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司），石蜡（上海华申康复器材有限公司）。

组织包埋机（浙江省益迪医疗设备厂），切片机（浙江省益迪医疗设备厂），展片机（浙江省益迪医疗设备厂），烤片机（浙江省益迪医疗设备厂），光学显微镜（德国 Leica），PCR 仪（美国 Bio-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 临床症状与组织病理变化观察 将具有典型临床症状的猪剖杀，取其肺组织进行PCR 鉴定，为阳性的肺组织经Bouin's 液固定后制作石蜡切片（厚度为6 μm），肺组织切片通过HE 染色观察组织病理变化。

1.2.2 病原体分离 其按照参考文献[13]进行。无菌采集肺脏病健交界处组织1～2 g，剪成米粒大小，放入KM2 液体培养基中，于37 ℃恒温培养；对培养基变色明显的进行PCR 检测，阳性结果立即传代，阴性结果放弃培养，待其生长滴度稳定后接种至固体培养基上。

1.2.3 形态学观察 将固体平板培养基置于倒置显微镜下，观察菌落的形态，取液体培养物12 000 g离心5 min，将沉淀物制成涂片进行瑞氏染色。

1.2.4 生化特性鉴定 将临床分离株进行尿素酶活性测定、葡萄糖水解试验、精氨酸水解试验、七叶苷水解试验、甘露醇分解试验，生化试验按参考文献[14]的方法进行。

1.2.5 分离株PCR 鉴定

1.2.5.1 16S rRNA 基因PCR 扩增 根据GenBank中Mhp 16S rRNA 基因的保守序列设计1 对特异性引物 F：5′-GGGTGAGTAACACGTACCTAAC-3′，R：5′-ACCGCGGCTGCTGGCACATAGT-3′。预期扩增片段436 bp，扩增体系为：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 3.2 μL，总体系 10 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 30 个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5.2 P36 基因 PCR 扩增 根据 GenBank 中报道的P36 全基因序列设计2 条扩增引物P1：5′-TT AGTGTCTCCCGTTATG-3′，P2：5′-GAAATCCGTAT TCTCCTC-3′。预期扩增大小为 621 bp，PCR 扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 5 μL，引物 P1（10 μmol/L）0.4 μL，引物 P2（10 μmol/L）0.4 μL，DNA 模板 1.5 μL，ddH2O 2.7 μL，总体系 10 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30 个循环；72 ℃8 min，4 ℃保存。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.6 菌落PCR 鉴定 用枪头蘸取数个平板培养基上的支原体菌落，代替1.2.5.2 反应体系中的DNA 提取物进行菌落P36 基因PCR 扩增，其中，ddH2O 用量改为7 μL，反应条件同1.2.5.2。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.7 测序及序列分析 将电泳产物送至华大公司进行测序，并同GeneBank 和现有的其他菌种进行序列同源性分析和比对，利用MEGA 5.2 软件对其进行分子进化上的亲缘关系分析。

2 结果与分析

2.1 组织病理变化结果

病猪体型消瘦，出现明显的腹式呼吸，被毛粗乱，精神沉郁，生长发育迟缓，消瘦少食（图1）；剖杀后眼观病肺两侧有不同程度肿大，病健界限明显，病变部位组织对称性实变，实变区大小不一，呈斑块形分布，质度硬实，缺乏弹性，呈典型的“虾肉样变”（图2）；镜检可见细支气管周围大量淋巴细胞，巨噬细胞浸润，形成“管套”，管腔内纤毛脱落，有大量的炎性细胞和脱落的上皮细胞，肺泡腔可见巨噬细胞、淋巴细胞、脱落的肺泡上皮细胞和少量的浆液，肺泡隔因增生，炎性浸润而增厚，呈典型的间质性肺炎特征。病肺组织损伤程度提示猪肺中的猪肺炎支原体毒力较强，严重影响猪的呼吸功能（图3）。

2.2 分离培养结果

培养基在3～5 d 后由红色变为淡黄色，提示变色后的培养物中含有猪肺炎支原体。变色后液体培养基颜色由红色变为淡黄色，培养液澄清透亮，无沉淀，不浑浊，提示培养基中含有猪肺炎支原体、且无杂菌污染（图4）。

2.3 形态学观察结果

固体培养基上可见多数呈圆形以及中间暗、边缘光滑的菌落（图5），与支原体菌落相符。液体培养物涂片用瑞氏染色后，经油镜观察到点状、两极状等大小在0.2 μm 左右的菌体（图6），与支原体大小相符。

2.4 生化特性分析

本试验的分离菌株生化特性符合支原体特性，与标准菌株168 相同，提示分离株为猪肺炎支原体（表 1）。

表1 分离菌株生化试验结果

2.5 PCR 鉴定结果

16S rRNA PCR 扩增结果提示，分离物中含有支原体；1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，标准菌株168 基因扩增出与预计大小一致的片段，证明该引物有效，同时分离株基因扩增出的条带大小与阳性对照 168 株一致（图 7）。

物种特异性P36 基因扩增结果提示，培养物中含有猪肺炎支原体，培养物基因扩增出与预计大小一致的特异性条带，与阳性对照一致（图8）。

2.6 序列比对结果

测序结果通过与GenBank 中登录的168 株（中国江苏）、168-L 株（中国江苏）、NCTC10127 株（瑞士）、J 株（巴西）、F7.2C 株（比利时）、7422 株（巴西）、7448 株（巴西）进行比对，使用 MEGA 5.2 构建NJ（Neighbor Jioning）树，采用 Bootstrap 检验方法，重复次数为1 000，得到进化树如图9 所示，该分离株与J 株、NCTC10127 株同源性较高，从分子水平上证明了分离株为猪肺炎支原体。

3 结论与讨论

本研究从猪支原体肺炎典型病理特征的猪肺中通过液体培养基盲传培养获得1 株支原体，瑞氏染色结果显示，该菌株大小在0.2 μm 左右，菌落形态呈典型的“煎蛋样”，边缘光滑。P36 基因PCR 测序结果与 168 株（中国江苏）、168-L 株（中国江苏）、NCTC10127 株（瑞士）、J 株（巴西）、F7.2C 株（比利时）、7422 株（巴西）、7448 株（巴西）进行比对，确认分离的支原体菌株为猪肺炎支原体，命名为JZ01 株。

本研究开展普查时对具有消瘦、气喘、明显的腹式呼吸、食欲不振等临床症状的猪群中体型偏小的“僵猪”进行剖杀，选取经PCR 鉴定为阳性及病理组织学检查为间质性肺炎的肺脏作为病料来源，在培养的过程中，3～5 d 培养基颜色变黄。培养基中的酚红起到指示剂的作用，培养液由红色变为淡黄色，其可作为观察有无支原体生长的一种直观简便的方法[15]。由于临床病肺中含有多种病原，Mhp 对生长环境要求苛刻，生长速度慢，在分离过程中不属于生长优势菌极易被其他杂菌干扰，研磨后的滤液通过0.45 μm 滤器，但仍有部分细菌可透过滤膜[16]。本试验采用多点取样，用液体培养基连续盲传的方法，培养液通过0.22 μm 滤器过滤不但能使分离株适应人工培养，而且能达到富集的目的，并利用物理方法有效去除细菌性病原。

16S rRNA 是所有原核生物蛋白质合成必需的核糖体RNA，可以用来标志生物的进化距离和亲缘关系，其具有高度稳定的保守区和可变区，根据保守区设计通用引物可以有效区别猪肺炎支原体和其他细菌[17]。本研究使用16S rRNA 保守序列设计引物对分离株的基因进行扩增，确认了分离菌株为支原体。

P36 基因控制Mhp 产生乳酸脱氢酶，其表面存在种属特异性抗原决定簇，因此，P36 蛋白产生的抗体也具有种属特异性[18]，采用Mhp 的P36 基因设计引物对猪肺炎支原体J 株、猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体进行检测，结果显示，只有猪肺炎支原体被扩增出来[10]，Mhp 感染后产生针对P36蛋白特异的抗体，与其他支原体无交叉反应[19]，提示P36 基因用于区分Mhp 和其他病原微生物具有高度的特异性。P36 基因PCR 扩增在检测典型猪支原体肺炎的病变肺脏中阳性率为100%，检测猪气管拭子敏感性为100%，特异性为93.3%[15]。本研究使用P36 基因序列设计引物对分离株的基因进行扩增，确认了分离株为猪肺炎支原体；通过对P36基因PCR 阳性产物测序并与NCBI GenBank 数据库登录的猪肺炎支原体菌株进行序列比对，结果显示，JZ01 株与J 株同源性较高但存在差异，提示目前猪肺炎支原体山西地方株发生变异，已对猪支原体肺炎灭活疫苗（J 株）产生免疫耐受性，灭活疫苗（J 株）无法提供全面的免疫保护。同时JZ01 株与国外致病株7448 株、7422 株的同源性比与国内168株高，提示JZ01 株可能由国外毒株进化而来，猪场在引进猪群时要提高检测水平，自繁自养是净化猪肺炎支原体的有效策略[20]。P36 基因序列含有大量的腺嘌呤和胸腺嘧啶，测序结果的突变碱基以A 和T 为主，碱基A、T 可能影响JZ01 株的毒力大小。

综上所述，本试验从最近发病的猪场成功分离到猪肺炎支原体山西地方株JZ01 株，一定程度上补充了山西地方株的菌株信息，并为深入研究猪肺炎支原体的致病机制奠定了基础。