妊娠期高血压疾病患者母儿血清及胎盘组织热休克蛋白27的表达及临床意义

李认认 朱锦明 王凤珍

[摘要] 目的 研究熱休克蛋白27（HSP27）在妊娠期高血压疾病孕妇静脉血、脐血及胎盘组织中的表达及临床意义。 方法 选取2018年6月—2019年6月于江苏省徐州市妇幼保健院分娩的妊娠期高血压疾病孕妇90例[其中妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组和重度子痫前期组，各30例]，同期另收集健康孕妇30例作为对照组。采用酶联免疫吸附法检测孕妇静脉血和脐血中HSP27水平;采用RT-PCR、免疫组织化学法检测胎盘组织HSP27 mRNA和蛋白的表达量。 结果 对照组、妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子痫前期组孕妇静脉血、脐血中HSP27水平均呈递增趋势，各组之间差异有高度统计学意义（P < 0.01）。对照组、妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子痫前期组胎盘组织HSP27 mRNA表达呈递增趋势，各组之间差异有统计学意义（P < 0.05）。对照组、妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子痫前期组胎盘组织HSP27蛋白表达量呈递增趋势，各组之间差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 妊娠期高血压疾病孕妇静脉血、脐血和胎盘组织中HSP27呈高表达，且HSP27的表达与妊娠期高血压疾病严重程度有关，提示HSP27可能参与妊娠期高血压疾病的发生、发展。

[关键词] 妊娠期高血压疾病;热休克蛋白27;胎盘;脐血;母血

[中图分类号] R714.24+6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）09（c）-0104-04

Expression and clinical significance of heat shock protein 27 in maternal and fetal serum and placenta of patients with hypertensive disorder complicating pregnancy

LI Renren1   ZHU Jinming2   WANG Fengzhen3

1.Graduate School， Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou   221004， China; 2.Department of Obstetrics， Xuzhou Maternal and Child Health Care Hospital， Jiangsu Province， Xuzhou   221009， China; 3.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou   221006， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of heat shock protein 27 （HSP27） in maternal and fetal serum and placental of patients with hypertensive disorders of pregnancy （HDP）. Methods Ninety pregnant women with gestational hypertension delivered in Xuzhou Maternal and Child Health Hospital in Jiangsu Province from June 2018 to June 2019 were selected （including 30 cases of gestational hypertension group， 30 cases of non severe preeclampsia group and 30 cases of severe preeclampsia group）. Another 30 healthy pregnant women were selected as control group. The levels of HSP27 in venous blood and cord blood of pregnant women were detected by enzyme linked immunosorbent assay， and the expressions of HSP27 mRNA and protein in placenta were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. Results The levels of HSP27 in venous blood and cord blood of pregnant women in control group， gestational hypertension group， preeclampsia （non severe） group and severe preeclampsia group showed an increasing trend， and the differences among all groups were highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of HSP27 mRNA in placental tissues of control group， pregnancy induced hypertension group， preeclampsia （non severe） group and severe preeclampsia group showed an increasing trend， and the differences among all groups were statistically significant （P < 0.05）. The expression of HSP27 protein in placental tissues of control group， pregnancy induced hypertension group， preeclampsia （non severe） group and severe preeclampsia group showed an increasing trend， and the differences among all groups were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion HSP27 is highly expressed in venous blood， umbilical blood and placental of pregnant women with HDP， and the expression of HSP27 is correlated with the severity of HDP， suggesting that HSP27 may play a role in the development of HDP.

[Key words] Hypertensive disorders of pregnancy; Heat shock protein 27; Placenta; Umbilical cord blood; Maternal blood

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，在我国的发病率为9.4%～10.4%，是导致孕产妇和围生儿死亡或并发其他疾病的主要原因之一[1]。迄今，妊娠期高血压疾病发病机制尚不清楚，可能为滋养细胞侵入子宫肌层过浅，子宫螺旋小动脉重铸不足，造成母体血管内皮细胞损伤，进而出现临床症状[2-4]。热休克蛋白27（HSP27）属热休克蛋白家族，在细胞受有害因素刺激（如缺血、缺氧、高温、寒冷、损伤和感染等）下产生[5-7]，能与错误折叠的蛋白相结合，发挥保护细胞功能作用。已有报道，子痫前期患者胎盘组织中HSP27表达较正常孕妇升高[8-9]，然而，孕妇静脉血、脐血中HSP27是否高表达，以及HSP27表达与妊娠期高血压疾病严重程度是否有相关性，目前还不清楚。本研究通过检测妊娠期高血压疾病孕妇的静脉血、脐血和胎盘组织中HSP27的表达情况，分析HSP27与妊娠期高血压疾病的关系，探讨其作为诊断指标在妊娠期高血压疾病中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年6月—2019年6月于江苏省徐州市妇幼保健院（以下简称“我院”）分娩的妊娠期高血压疾病孕妇，按照谢幸等[10]主编的《妇产科学》第9版关于妊娠期高血压疾病诊断与分类标准，入选妊娠期高血压、子痫前期（非重度）、重度子痫前期孕妇为妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子痫前期组，各30例;另收集健康孕妇30名为对照组。纳入标准：单胎;妊娠期高血压疾病组符合妊娠期高血压疾病诊断标准;择期剖宫产终止妊娠。排除标准：既往心、肝、肾，内分泌及免疫系统疾病史;既往慢性高血压、糖尿病史;胎膜早破;母儿感染。四组孕妇的平均年龄为（31.00±5.94）、（30.33±5.50）、（27.73±4.54）、（30.60±6.38）岁，分娩孕龄为（38.77±0.90）、（38.70±1.06）、（38.77±1.04）、（38.27±0.94）周。四组孕妇的年龄及分娩孕龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有受试者均签署知情同意书，试验方案经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 标本采集

所有研究对象入院次日空腹抽静脉血4 mL，胎儿娩出后立即抽胎盘脐血4 mL，静置30 min，3000 r/min离心10 min，离心半径13 cm，吸取上层血清，置-80℃冰箱保存，用于酶联免疫吸附法（ELISA）;胎盘娩出后，取胎盘母体面近中央处2块大小1 cm×1 cm×1 cm组织块，DEPC水冲洗，1块置于EP管中，立即液氮冷冻后移至-80℃冰箱保存，用于RT-PCR法;另1块置于10%的中性甲醛中固定24 h，用于免疫组织化学法。

1.3 ELISA法检测静脉血和脐血中的HSP27水平

ELISA试剂盒购于Wuhan Fine Biotech CO公司，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4 RT-PCR法检测胎盘组织HSP27mRNA表达水平

RNA快速抽提试剂盒（R401-01）购于南京诺唯赞生物科技公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，HSP27上游引物：5′-CAAGGATG-GCGTGGTGGA-3′，下游引物：5′-TCTCGTTGGACTG-CGTGGC-3′;产物片段长度197 bp。β-肌动蛋白（β-actin）作内参照，上游引物：5′-GTCAGTGGTGGACC-TGACCT-3′，下游引物：5′-AGGGGAGATTCAGTGTG-GTG-3′;产物片段长度395 bp。按试剂盒操作说明进行操作，HSP27扩增反应条件：94℃预变性30 min;94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环;72℃延伸5 min。以HSP27与β-actin 的灰度比表示其相对含量。

1.5 免疫组织化學法检测胎盘组织HSP27蛋白的表达

微波修复抗原，加一抗（武汉博士德生物工程有限公司）后4℃孵育过夜，加生物素化二抗和辣根酶标记链霉亲和素（北京中杉金桥生物技术公司），二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察。根据阳性细胞百分率和细胞染色强度确定HSP27蛋白的表达水平。采用综合计分法进行半定量分析[11]，以胞膜或胞质出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，无着色或与背景颜色一致的为阴性细胞;计算阳性细胞百分率，阳性细胞百分率≤5%为0分，>5%～25%为1分， >25%～<50%为2分，≥50%为3分;根据多数细胞的着色强度计算强度得分，无着色为0分，浅棕褐色为1分，棕褐色为2分，深褐色为3分;两者相加后，0～1分为阴性“-”，2分为“+”，3～4分为“++”，5～6分为“+++”。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0进行统计分析。检验数据正态性及方差齐性后，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。等级资料多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，进一步两两比较采用扩展了的t检验。所有检验均为双侧，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组孕妇静脉血、脐血中HSP27水平比较

对照组、妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子痫前期组孕妇静脉血、脐血中HSP27水平均呈递增趋势，各组之间差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 各组胎盘组织HSP27 mRNA表达比较

对照组、妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子痫前期组胎盘组织HSP27 mRNA表达呈递增趋势，表达水平分别为0.451±0.037、0.628±0.036、0.943±0.039、1.740±0.082，各组之间差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.3 各组胎盘组织HSP27蛋白表达

对照组、妊娠期高血压组、子痫前期（非重度）组、重度子癇前期组胎盘组织HSP27蛋白表达量呈递增趋势，阳性表达率分别为36.6%、86.7%、93.3%、100.0%，各组之间差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表2。

3 讨论

HSP27为小分子热休克蛋白，具有分子伴侣样活性，可阻止变性蛋白或错误折叠蛋白聚集;稳定细胞骨架;抗氧化应激;抑制细胞凋亡的作用[12-15]。大量研究表明，大量热休克蛋白在妊娠期高血压疾病中均有不同程度的升高[12-15]。

本研究结果显示，妊娠期高血压疾病孕妇母血、脐血中HSP27表达升高，且随疾病严重程度的增加而升高。母血中HSP27也许并非来自胎盘，可能为氧化应激胎盘释放的胎盘因子进入到母体血液循环，引起母体的炎症反应及氧化应激反应，从而造成母体血管内皮损伤，HSP27作为保护性应激蛋白，反应性表达升高，保护内皮组织免受损伤，这与关于动脉粥样硬化的研究一致[16]。妊娠期高血压疾病胎盘组织中HSP27 mRNA和蛋白的表达均升高，且随疾病的严重程度呈显著升高的趋势。妊娠期高血压疾病胎盘组织存在氧化应激反应，胎盘组织中活性氧自由基生成增加、线粒体功能受损[17]。HSP27可通过提高葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性、增加细胞内谷胱甘肽的含量，提高细胞的抗氧化应激能力[18];HSP27可与细胞色素C相互作用，抑制pro-caspase-9的激活，还可与pro-caspase-3直接作用，发挥抗凋亡的作用[19];HSP27还可阻止细胞膜上的Fas死亡受体与其Fasl结合，抑制细胞凋亡[20]。

本研究发现，HSP27在妊娠期高血压疾病中的表达与疾病的严重程度相关，提示HSP27可能参与妊娠期高血压疾病的发生。母血中HSP27表达随疾病严重程度增加而升高，其可作为早期诊断及疾病严重程度的监测指标之一;进一步研究如何增加HSP27对滋养细胞的保护功能，有望今后对妊娠期高血压疾病的防治提供新的治疗策略。

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（收稿日期：2020-03-01）