水质毒性精确检测的斑马鱼胚胎心率观测系统

王甘翔，唐 古，彭 頔，李媛媛，杨 庆，李飞鹏,*

(1. 平湖市渔业技术推广中心，浙江嘉兴 314200；2. 上海理工大学环境与建筑学院，上海 200093)

斑马鱼胚胎对有毒有害物质非常敏感，已经成为国际上生物医学和环境毒理学的标准模式生物，广泛应用于常规毒性试验、分子及细胞生态毒理研究和生物诱导效应检测等多个方面。国际标准组织已将斑马鱼推荐为河水毒性检测的试验鱼种，并提出了相应的标准方法(ISO 07346)；我国生态环境部亦发布了《水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法》(HJ 1069—2019)，适用于测定地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性。斑马鱼饲养容易，利用其胚胎的毒性检测方法具有节约空间、费用低等诸多优势，因此，在生态毒理学研究和水环境检测等领域得到了广泛的应用[1]。在利用斑马鱼胚胎评价环境污染物毒性时，致死性反应毒理学终点是环境安全评估的一项重要指标；但是，在自然水生态系统中，污染物通常具有浓度低、种类多、成分和作用机制复杂等特点，受污染的生物通常表现为畸形、突变等非致死性反应。通过观测经毒性物质染毒条件下鱼卵胚胎心跳的情况，判断鱼卵胚胎发育的毒性效应，是评价分析毒性物质的一种重要方法，同时，胚胎的心率变化也是相对较早可检测到的指标。

当前，针对斑马鱼胚胎的心率监测，多依赖于显微镜观测的计数方法，准确性受观测者主观判断的影响较大。在研究不同酒制大黄对斑马鱼胚胎发育的影响时，朱淑珍等[2]采用倒置光学显微镜和CCD数码摄像机对胚胎的发育终点进行研究，统计胚胎发育全过程的死亡数和畸形数，拍照记录发育状态，录像并以人工计数心率；然而，这种基于斑马鱼胚胎录制视频文件、以人工计数心率的方式具有工作量大、存在误差等劣势。此外，当前斑马鱼胚胎心跳观测普遍采用24孔板染毒，置于显微镜观测并计数胚胎心跳。在这种观测环境下，鱼卵胚胎和试验培养液直接暴露于室内空气中，难以保证较好的观测条件，同时也会影响试验的准确性[3]。计算机视觉是使用计算机及相关设备对生物视觉的一种模拟技术，能够代替人眼对目标进行识别、跟踪和测量，并可以进一步对图形进行处理和分析，在水环境监测和生态学研究中逐渐开始得到广泛应用[4-6]。针对水质毒性试验和评价的需求，本研究基于计算机视觉技术，建立了精确检测斑马鱼心率的自动观测系统，并进行了初步验证，旨在提高斑马鱼毒性检测方法的效率和精度，为水质毒性检测方法提供一种新思路。

1 材料与方法

试验所用的斑马鱼购自同济大学长江水环境教育部重点实验室，个体长度为4～5 cm，饲养于充分曝气的自来水中，水温保持在(26±1)℃，pH值控制在7～8，光照/黑暗周期控制为14 h∶10 h。每日喂食2次(冷冻红线虫，购于上海曲阳花鸟市场)，并辅助混合干饲料喂食以增加产卵量。斑马鱼饲养3个月以上并达到性成熟后进行试验，饲养期间活动正常、无死亡。一般，斑马鱼卵胚胎在受精24 h后(24 hpf)心脏发育成形，即可在显微镜下观测到心跳[7]。

试验前夜，在暗室内将产卵器放入鱼缸，亲鱼按1∶2雌雄比放入产卵器内，中间用隔板隔开，下方放置鱼卵收集器，次日清晨抽出隔板，光照30 min以刺激斑马鱼产卵。取出鱼卵收集器，用阔口胶头滴管(管口直径大于卵径)将卵吸出，然后用标准稀释水清洗鱼卵数次，以除去粪便等杂质，挑选出正常的受精卵培养备用。

标准稀释水配置参照《水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法》(HJ 1069—2019)的方法进行。

2 心率观测系统构建

2.1 心率观测系统设计

心率观测系统由实验室卵胚胎培养装置、组装的高速摄像显微镜和视频图像心率识别程序组成。实验室卵胚胎培养装置结构如图1所示。组装的高速摄像和显微镜系统采用高清(1 920×1 080/50P)摄像机，在APS-C商用画幅下能得到0.1 μm2/ Pixel(像素)的分辨率；显微镜采用光学倒置显微镜(Olympus CKX41)(图2)。

图1 实验室卵胚胎培养装置结构示意图Fig.1 Structure Diagram of Laboratory Culture Device for Zebrafish Embyro

图2 计算机视觉系统装置Fig.2 Picture of Computer Visual System

为了得到较准确的斑马鱼卵胚胎心跳观测结果，需控制观测装置的环境温度、光照等因素以保证鱼卵胚胎的正常发育，并防止外界污染物进入培养液，从而保证单一变量试验，同时需保证胚胎固定稳固，以利于观测。因此，本研究自行设计了鱼卵胚胎培养装置，由相互连通的容纳单元、恒温水流动单元组成，可固定于组装的高速摄像显微镜载物台。

容纳单元腔室为圆柱形，由上盖板、下底板、侧板构成腔室，腔室与侧板之间、腔室与腔室之间均留有空隙。腔室的数量设置为4个，内径为2 cm，深度为2 cm，每个腔室均设置上部的高位换水孔和下部的低位换水孔，相错设置，同时与侧板连通。

上盖板、下底板及腔室内均填充透光纤维团，为腔室提供一定的光源，保障观测时的光线条件。使用中上盖板盖合，使得鱼卵胚胎心跳观测装置封闭，防止外界污染。充氧的恒温水通过高位换水孔向低位换水孔持续流动，为腔室内斑马鱼卵胚胎生存提供了充足的氧气和恒温水浴条件；换水孔径较小(3 mm)使得腔室内水体流动较缓，加上腔室内填充的纤维团缓冲了水体流动对腔室造成的冲击，腔室底部的纤维絮层固定鱼卵胚胎，总体上防止了观测中鱼卵胚胎抖动影响观测结果的准确性。

2.2 胚胎染毒方法

在对Schulte等[8]的研究方法进行改进的基础上，采用自主设计加工的卵胚胎培养装置(图1)进行染毒试验。挑选出4枚24 hpf正常受精卵置于培养装置胚胎放置腔内，组装好培养装置，利用染毒试液构建恒温水浴环境对胚胎进行染毒。

在室温与目标温度相近的情况下，将染毒试液由泵水管与恒温进水口相连，控制压力保持胚胎腔室液位稳定，不溢出。试验时，先将位于透光上盖板内壁上的标记黏结固定合适大小、形状的纤维团(透光化纤)，再将进样泵一端连接恒温水源，进样泵另一端连接进水孔；在进样泵作用下，恒温水通过进水孔进水，进入容纳单元，充满侧板与腔室之间及腔室相互之间的空隙以及各个腔室，然后通过出水孔流出。控制水压，保持腔室水位稳定后，通过吸管将卵胚胎放入腔室底部，再铺上脱脂棉薄层，使鱼卵胚胎固定在纤维絮层上，并盖上已黏结纤维团的上盖板，封闭腔室，随着上盖板盖合，纤维团即可插入纤维絮层并填充腔室，之后将该装置放置于倒置显微镜上，通过透光的下底板观测鱼卵胚胎心跳的情况，进行观察及视频录制。

室温与目标温度相差较大会影响胚胎生理指标，此时，只需将进样泵水管连接水体恒温装置后再与恒温进水口相连即可。

2.3 视频图像心率识别方法

视频文件由心率识别程序处理后得到胚胎心率指标。心率识别程序采用Matlab数学软件编写，通过对基于灰度变化的斑马鱼心室图像面积的Matlab程序编码。编写的8组M码文件可以组合应用于Matlab软件，对视频图像文件不同部分进行黑色和白色处理，最终得到心室面积的实时变化值。心室面积变化值反映了心脏的收缩和扩张，心室面积值-时间曲线的2次波峰之间的时间间隔内即发生了1次完整的心跳。因此，通过对心室面积值-时间曲线的分析即可得到心率，从而实现心室图像心率识别。

3 方法验证实例

为观测正常的斑马鱼胚胎心跳，以日常放置半天的自来水为试验试剂，通过上述心率检测系统进行正常环境下斑马鱼胚胎的观测、视频录制和心率识别，以验证本研究构建的观测系统的准确性。本例所用视频文件总时长为6 min，心率识别程序每隔0.02 s对视频图像进行1次处理，共得到18 000个面积数据值。

利用Excel 2013从所得的面积数据值中随机选取5组连续5 s内的数据值，根据各面积-时间曲线图总体趋势，5组曲线走势类似，且均可清晰地分辨出波峰数量，数据波峰数量均为9，随机抽取的1组心室面积值-时间折线图如图3所示。为判断心率与波峰的对应关系，对心率识别程序所用视频文件进行人工计数，同样采用随机选取4组1 min时长进行计数，所得结果分别为112、105、108、114次/min，平均心率为110次/min。1 min斑马鱼胚胎平均心跳数为108次，与人工计数所得几乎一致，波峰与心率基本吻合，说明通过构建的计算机识别程序可准确计数斑马鱼胚胎的心率变化。Park等[9]在利用斑马鱼心脏毒性模型预测药物引起心率过缓情况时，使用立体显微镜对斑马鱼卵胚胎心率进行30 s人工计数，发现未染毒对照组斑马鱼卵胚胎平均心率为105次/min；Chakraborty等[10]在研究咖啡因、诺氟沙星和尼美舒利对斑马鱼胚胎心率影响时，发现空白对照组的斑马鱼卵胚胎平均心率为110次/min。斑马鱼心率观测系统所得平均心率值与上述已有研究结果十分接近，且其结果与人工计数结果相差无几，同时，在观测操作和心率计数方面具有更加便捷、快速和精确的优势。

图3 随机抽取的心室面积-时间曲线图Fig.3 Random Selection of Ventricular Area-Time Curve

采用混合地表径流样品为试验试剂进行培养，分别用显微镜人工观测和本系统观测斑马鱼胚胎心率。显微镜观测斑马鱼胚胎发育48 h的心率为(153±13)次/min，本系统观测的平均值为151次/min，与人工技术结果一致，进一步说明了系统观测的准确性。

4 方法应用讨论

在以斑马鱼为受试生物的环境毒理学研究中，斑马鱼胚胎心率在不同浓度染毒试剂中的变化情况已有广泛的研究。叶露[7]采用倒置显微镜对斑马鱼胚胎进行15 s人工计数，得到了不同浓度全氟辛酸(PFOA)和全氟化合物(PFCs)所对应的斑马鱼胚胎平均心率值；杨洋等[11]发现了双酚AF暴露对胚胎期的毒性效应，构建了不同浓度的双酚AF所对应的斑马鱼胚胎平均心率；Wu等[12]在研究上海市高架道路降雨径流水质毒性时，采用斑马鱼作为受试生物，得到了不同批次降雨径流所对应的斑马鱼平均心率。同时，这些研究的斑马鱼胚胎心率变化构建出染毒试剂浓度和斑马鱼胚胎心率关系曲线，含有对应污染物的水质，即可通过斑马鱼胚胎心率变化进行定量化表征，从而实现水质情况的快速、实时监测。在心率计数时，人工计数的方式造成的误差是不可避免的，且误差大小具有不确定性，虽然同样可以取多组人工计数求出平均心率，但由于人工计数耗时较多，数据组不可能取无限多次以减小误差。本研究所提供的斑马鱼心率观测系统，基于计算机视觉技术，可随机选出足够多组数据进行分析，从而实现心率结果误差最小化。本研究提供的方法可在后续的研究中构建更多的水体污染物浓度与心率关系曲线，实现对水质的快速检测。同时，斑马鱼心率观测系统能够更好地模拟自然环境，可以对卵胚胎发育全过程进行实时观测和图像提取分析，在研究胚胎发育形态方面也具有较大优势。在对污染物浓度变化大的降雨径流水质和毒性比较时，Chen等[13]发现，基于传统方法的水质评价并不能完全反应降雨径流的生态毒性水平，应考虑同时进行径流的毒性和水质检测。本方法可在观测斑马鱼胚胎毒理学指标的同时，构建在线监测系统进行水体水质监测，可实现水质指标和生态毒性指标的协同在线检测。

5 结语

本研究提供了一种斑马鱼心率观测系统的建立方法，改进了胚胎观测的条件，能够更好地模拟斑马鱼胚胎发育的自然环境，从而使观测结果更加准确；通过编写的视频图像心率识别程序，与传统人工计数方式相比，基于计算机视觉的胚胎心率计数更加高效、快速和准确；斑马鱼心率观测系统在检测系统中的应用验证了系统的可行性和准确性。在具体的水质检测应用中，可以采用斑马鱼卵胚胎在水样中染毒，构建出心率与水质变化的规律，从而通过心率变化实现对水质和毒性的实时协同监测。