正交试验法优化呼伦贝尔野生柴胡总皂苷的提取工艺

邓庆华 李敬聪

(呼伦贝尔学院 内蒙古 海拉尔 021008)

前言

柴胡作为中国的传统中药材之一，它的药用历史十分久远，需求较高，用途十分广泛，好处繁多。柴胡具有和解表里、疏肝解郁、举阴盛阳之功效。而柴胡的主要药效物质是柴胡皂苷和挥发油等。其中，柴胡皂苷主要为三萜皂苷，对感冒发热、胸胁胀痛、月经不调等具有十分重要的作用。鉴于柴胡及其活性成分的药理研究发现，提示柴胡有可能开发成为治疗包括癌症、肝炎、精神抑郁和癫痫病等多种疾病的创新药物[1]。现如今，对于柴胡的利用，不再局限于传统的对药材的直接煎煮，而是通过各种方法将柴胡中的有效成分提取出来，制成药品。目前对于柴胡有效成分的提取方法已有浸渍法、渗漉法、回流法、正丁醇萃取法、甲醇或乙醇提取—乙醚或丙酮沉淀法、异丙酮溶解重结晶法、超声提取法、大孔吸附树脂法、微波辅助提取技术、超临界CO2萃取法、膜技术、水提技术[2][3]。但是，由于柴胡生长缓慢，市场需求较大，供不应求。长期采挖，导致野生资源和环境遭到破坏。

因此，为节省资源、提高以柴胡皂苷为主要成分的药剂的生产率，降低生产成本，本试验采用呼伦贝尔陈巴尔虎旗野生柴胡为研究对象，陈巴尔虎旗位于内蒙古呼伦贝尔市西北部，地处呼伦贝尔大草原腹地，地理坐标为北纬48°48′～50°12′，东经118°22′～121°02′，地势由西北向东南逐渐降低，年平均风速为3.5m/s，属于中温带半温润和半干旱大陆性气候，野生药材十分丰富。本试验以溶剂的浓度、提取时间、料液比、和PH四个因素进行正交试验，采用紫外分光光度法测定柴胡总皂苷的含量，对柴胡总皂苷的提取工艺进行优化，为呼伦贝尔地区野生柴胡的利用提供参考。

1 仪器与药品

柴胡皂苷a对照品(成都曼斯特生物有限公司)，丙二醇(天津市大茂化学试剂厂)，无水乙醇(天津市天利化学试剂有限公司)，甲醇(天津市大茂化学试剂厂)，正丁醇(科密欧化学试剂有限公司)，石油醚(天津市天力化学试剂有限公司)，磷酸(天津市宇精细化工有限公司)，氨水(天津市密欧化学试剂有限公司)，对二甲氨基苯甲醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)，紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司TU-1810PC)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-52AA)。

2 研究方法

2.1样品处理：将采集好的柴胡根部洗净后于60℃下进行烘干至恒重、粉碎备用。使用相应浓度的乙醇溶液浸泡2小时。

2.2正交试验因素水平的设定

选用乙醇为提取溶剂，选取溶剂的浓度、提取时间、PH和料液比四个因素，每个因素选取三个水平，见表1。

表1 正交试验因素及水平

2.3制备对照品溶液：精密称取柴胡皂苷a 10.00mg置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得柴胡皂苷a 对照溶液。

2.4标准曲线的制备：精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1ml制备好的对照样品溶液置于试管中，编号。向每只试管中分别加入1ml对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液，摇匀，在70℃恒温水浴锅中水浴加热10min后取出，冷却至室温。在向每只试管中加入5.0ml磷酸，在70℃恒温水浴锅中水浴加热10min后取出，冷却至室温后用甲醇定容10ml。将液体分别置于比色皿中，在536nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，柴胡皂苷a的浓度(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线[4-6]。见图1。

图1 标准曲线

通过图1可以得出标准曲线为A=3.5871C+0.013，R2=0.9941。柴胡皂苷在0～0.2mg/ml范围呈现出良好线性关系。

2.5正交试验：根据因素水平表，选用L9(34)表进行试验。提取液减压浓缩后用石油醚萃取三次每次10ml，弃石醚油后用水饱和正丁醇萃取三次。合并正丁醇，减压浓缩干燥后残渣用甲醇溶解并定容至25ml[4][7]。采用紫外分光光度法测定536nm处吸光度。

3 结果与分析

按照L9(34)正交表进行试验，结果见表2。

表2 正交试验结果

续表2

由表2可知，四个因素对柴胡总皂苷提取效率的影响顺序为：提取时间>料液比>PH>溶剂浓度。其中溶剂浓度的三个均值中k2最大，同理得出提取时间k3、料液比k3和PH k3的均值最大。所以，柴胡总皂苷的最佳的提取工艺是PH为10～11，8倍料液比、75%乙醇、提取3小时。

以极差最小的溶剂浓度一列作为误差列，对试验结果进行方差分析，见表3。

表3 方差分析

由表3可知，提取时间和料液比对柴胡总皂苷提取效率的影响差异显著P<0.05；提取溶液PH对柴胡总皂苷提取效率的影响差异不显著P>0.05。结果表明提取时间和料液比对柴胡总皂苷的提取效率影响较大，提取溶剂的PH对柴胡总皂苷的提取效率影响不大。

4 讨论与结论

在选择的四个因素即提取时间、提取溶剂的浓度、料液比与PH中，提取时间和料液比对柴胡总皂苷提取效率的影响差异显著；提取溶液PH对柴胡总皂苷提取效率的影响差异不显著。提取时间对柴胡总皂苷提取效率影响最大，但是通过对试验数据的观察，提取时间为3h所得的试验数据并没有比提取时间为2h高出太多，这可能与柴胡皂苷的性质有关，柴胡皂苷长时间受热会分解，从而导致柴胡总皂苷提取率降低，与张玲[8]等研究一致。而且柴胡总皂苷作为柴胡的主要有效物质，它和柴胡的药效息息相关，所以，要在尽可能的减少柴胡总皂苷因为受热分解的情况下来延长提取时间，确保将柴胡总皂苷充分提取出来。以免因为提取时间过长，导致柴胡总皂苷分解，形成对药材的浪费。张国松[9]等在其试验结果的方差分析中显示提取时间并没有显著差异，而本试验中提取时间具有显著差异，这可能是由于时间水平的设置所造成的影响。张国松[9]等设计的时间水平间距较小，可能造成区分度不够高，最终导致试验结果显示为提取时间对柴胡总皂苷的提取率影响不大。所设定的PH的三个梯度对最终试验结果影响不显著，柴胡皂苷在弱碱的环境下稳定，碱性太强反而可能不利于保持柴胡皂苷的稳定性，这与张国松[9]等研究一致。提取溶剂的浓度对柴胡总皂苷的提取效率影响不大，造成这种现象的原因可能是由于柴胡皂苷在一定浓度的醇溶液中有沉淀损失，这与张玲[10]等人的研究一致。

本试验从影响柴胡总皂苷的四个因素(提取时间，提取溶剂的浓度，料液比以及PH)入手，用正交试验法对柴胡总皂苷的提取工艺进行优化，结合极差分析、方差分析，以减少生产成本、保护环境为本，最终确定了柴胡总皂苷的最佳提取工艺为采用75%的乙醇为溶剂、8倍料液比、PH在8～9之间提取3个小时。