干扰UCH-L3 对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

2020-11-18朱菲菲王轶敏张林林郭益文丁向彬

中国畜牧杂志 2020年11期

胡蕾，朱菲菲，王轶敏，张林林，李新，郭益文，郭宏，丁向彬

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384）

骨骼肌中的肌卫星细胞在肌纤维受损后可增殖、分化、融合成为成熟的肌管或肌纤维来修护受损的肌细胞[1-2]。真核细胞中80%以上的细胞内蛋白质的降解由泛素-蛋白酶体完成。主要包括泛素化、蛋白酶体降解、去泛素化3 个过程[3]。去泛素化是指已经泛素化的蛋白质在去泛素化酶的作用下水解泛素分子。泛素蛋白酶体中羧基末端水解酶L3（Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3，UCH-L3）属于UCHs 家族，可以将泛素分子从底物上水解下来，使泛素能够循环利用。UCH-L3定位于小鼠的第14号染色体[4]，主要位于造血组织中[5]。已有研究表明，UCH-L3 可以与Smad1 相互作用，显著降低多聚泛素化的Smad1，可以通过微调Smad1 信号来加强成骨细胞的分化[6]。UCH-L3-/-小鼠中UCH-L3 的缺失会导致骨骼肌中AMP 活化和蛋白激酶活性增强[7]。同时，UCH-L3 缺失会造成小鼠骨骼肌退化及发育受阻[8]。以上研究提示UCH-L3 可能在细胞分化和肌肉发育过程中发挥重要的调控作用，但UCH-L3 对牛肌肉发育分化是否具有调控作用还不清楚。本研究利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型，模拟牛骨骼肌生长发育过程，通过干扰UCH-L3 在牛骨骼肌卫星细胞中的表达，研究UCH-L3对牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源细胞为天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室分离冻存的原代牛骨骼肌卫星细胞。

1.1.2 主要试剂和仪器主要试剂包括DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、马血清（HS）、Opti-MEM Medium （Gibco）；TRIzolTMReagent，Lipofectamine 3000（Invitrogen）；RIPA 裂解液、电泳缓冲液、电转缓冲液、曝光液、TBS 和PBS（北京索莱宝公司）；Mouse Anti-MyHC Monoclonal Antibody（DSHB）、Mouse Anti-GAPDH Monoclonal Antibody、goat antimouse IgG、goat anti-rabbit IgG（北京中杉金桥公司）；Rabbit Anti-UCH-L3 Monoclonal Antibody（BBI）；FITC-conjugated Goat Anti-X（博士德生物）。

主要仪器为CO2培养箱（Thermo-scientific）、Light Cycle 96 荧光定量PCR 仪（Roche）、荧光倒置显微镜（Leica）、电泳仪（Bio-Rad）等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化参考本实验室已建立的方法进行[9]，复苏前期实验室分离冻存西门塔尔牛的骨骼肌卫星细胞，待细胞汇合度为80% 时进行传代培养，用生长培养基（DMEM+20%FBS+1%青链霉素）进行培养，当细胞汇合度达80%后，更换为分化培养液（DMEM+2%HS）继续培养。

1.2.2 细胞转染根据UCH-L3序列设计干扰RNA，并由广东锐博公司合成。将牛骨骼肌卫星细胞接种于24 孔板，设置实验组和对照组，每组3 个重复，待细胞密度至80%时进行转染，每孔吸弃50 μL 培养基，将25 μL 的Opti-MEM 培养基和1.5 μL 的lip 3000 转染试剂混合液，25 μL 的Opti-MEM 培养基和2.5 μL 的siRNA 混合液分别室温孵育5 min，再将两者混合后室温孵育15 min，每孔细胞加入50 μL 此混合液，转染6 h后将转染液吸弃，加入增殖培养基。

1.2.3 EdU 细胞增殖检测将牛肌卫星细胞传代接种于96 孔板，设置4 个生物学重复，按照Cell-Light EdU Apollo In Vitro Imaging Kit 试剂盒说明书操作，第一步EdU 标记，接着细胞固定，然后Apollo 染色，最后DNA 染色。荧光显微镜下检测EdU 阳性细胞数和总细胞数。

1.2.4 免疫荧光染色法检测分化后肌管中MyHC基因将牛肌卫星细胞传代接种于48 孔板，转染细胞。进行成肌诱导分化，分化第3 天时开始检测。用预热的PBS清洗细胞2 次。加入4%的多聚甲醛固定30 min，然后用PBS 清洗3 次。用含0.1%Triton X-100 的PBS 室温通透细胞20 min，PBS 洗3 次。用5% 的BSA 室温孵育30 min，弃BSA，不洗。加入一抗，于湿盒中4℃过夜孵育。PBS 清洗3 次，每次5 min，然后加入相应的二抗100 μL，37℃避光孵育1 h。PBS 清洗3 次，每次5 min。加入100 μL Hoechst33342避光染色5 min，吸弃，加PBS 后荧光显微镜观察拍照。

1.2.5 荧光定量PCR 检测干扰后的UCH-L3 和分化标志因子荧光定量 PCR 体系：cDNA 2 μL，Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase free water 7 μL。荧光定量 PCR 程序：预变性：95℃，60 s；变性：95℃ 10 s；退火：61℃ 20 s；延伸：72℃ 15 s；35 个循环；熔解曲线：95℃ 10 s；65℃ 60 s；97℃ 1 s；冷却：37℃ 30 s。

表1 qRT-PCR 引物信息

1.2.7 Western blot 检测分化标志因子将6 孔板中的4 个时期的细胞用蛋白裂解液裂解，收集蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，根据浓度将蛋白变性。在通过Western blot法检测分化标志基因MyHC蛋白的表达量，具体步骤参考实验室已建立的方法进行[9]。

1.3 统计分析 EdU 阳性细胞率和免疫荧光肌管融合率用卡方检验分析，荧光定量PCR 和Western blot 的结果用t检验分析（SPASS 和Image Lab），P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，P＞0.05 表示不显著。

2 结果

2.1 牛肌卫星细胞分化前后UCH-L3 表达量的检测提取牛骨骼肌卫星细胞分化前后的蛋白，通过Western blot 检测发现，UCH-L3 表达在牛肌卫星细胞成肌分化前后存在显著差异（图1），在牛骨骼肌卫星细胞中，增殖细胞和分化细胞中的UCH-L3 mRNA 水平无明显差异，蛋白水平增殖期显著高于分化期，肌卫星细胞分化过程中UCH-L3 蛋白水平的变化提示UCH-L3 对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程具有重要的调控作用。

2.2 UCH-L3-Si-RNA 的设计及干扰效果检测根据UCH-L3 序列设计si-RNA（si-UCH-L3-1、si-UCH-L3-2、si-UCH-L3-3、si-UCH-L3-4、si-UCH-L3-5），通过荧光定量PCR 技术检测转染24 h 后牛肌卫星细胞中 UCH-L3的表达量。如图2 所示，设计的5 条si-RNA 均具有显著的干扰效果，其中si-UCH-L3-3 对UCH-L3 的干扰效果最明显。

用si-UCH-L3-3 转染牛骨骼肌卫星细胞，进一步利用Western blot 技术检测si-UCH-L3-3 干扰效果。如图3所示，相比较si-NC 组，实验组的UCH-L3 在蛋白水平也显著降低，说明si-UCH-L3-3 可用于进行下一步实验。

2.3 干扰UCH-L3 表达对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响如图4 所示，对照组和实验组阳性细胞无明显差异，说明干扰UCH-L3 对细胞增殖无明显影响。

2.4 干扰UCH-L3 表达对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响如图5 所示，干扰UCH-L3 表达后形成的肌管明显少于对照组，肌管融合指数显著低于对照组。如图6 所示，实验组MyHC 的蛋白水平显著低于对照组。以上结果表明干扰UCH-L3 表达能够抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。

3 讨论

正常生物的骨骼肌质量占体重的40%，运动型生物的骨骼肌质量占体重的50%，骨骼肌维持着生物体正常的活动[10]。成肌细胞可以增殖和分裂，但一旦融合成肌纤维和肌管便失去增殖能力[11-12]。成肌细胞在肌肉发育和肌肉损伤修复中具有重要作用，在小鼠肌肉内注入成肌细胞，其修复速度明显加快[13]。成肌细胞需要经过增殖、分化及融合的顺序才能成为肌肉纤维[14]。本研究使用已经建立的牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化模型，可以很好地在体外模拟骨骼肌的发育过程。

去泛素化酶对体内的蛋白泛素化过程起着调控作用，去泛素化酶可以水解底物与泛素链之间的硫酯键，一方面在底物靶蛋白降解时避免泛素链也被降解，另一方面还能阻止靶蛋白被过度降解，即实现对底物靶蛋白降解的调控。去泛素化酶中大部分为半胱氨酸蛋白酶，根据其泛素-蛋白酶结构域又可分为泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Proteases，USP）、碳末端水解酶（Ubiquitin C-terminal Hydrolases，UCHs）、卵巢肿瘤相关蛋白酶和MJD 酶（含Machado-Joseph 结构域）4 个亚类。去泛素化酶对泛素-蛋白酶体降解过程的调节参与很多重要的生物过程，如细胞周期的调控、生长和分化以及肿瘤的发生[15-16]，其中泛素特异性蛋白酶和碳末端水解酶研究较多。USP19 在萎缩的肌肉中表达增加，说明泛素蛋白酶体系统可能在骨骼肌中被激活，增加了蛋白的降解，抑制了蛋白的合成[17]。有报道证明敲除USP4（一种去泛素化酶）改变了MyoD 水平和C2C12 细胞中肌生成标记蛋白水平，从而促进了肌生成，故而将USP4 鉴定为肌源性调节因子（MRF）的抑制剂[18]。UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5/UCH-L37 和BRCA1 相关蛋白1（BAP1）是目前发现的人类碳末端水解酶亚家族的主要成员。UCH-L1基因敲除小鼠的比目鱼肌中的肌管比对照组大，C2C12 成肌细胞中肌管较对照组也是增大的[19]。在小鼠成肌细胞C2C12 中用si-RNA 敲低UCH-L1基因表达抑制了细胞增殖，促进了细胞分化和肌管形成[20]。UCH-L3 具有促进胰岛素信号转导从而促进脂肪形成的作用[21]。UCH-L3 可以使多聚泛素化底物蛋白去泛素化。有研究表明UCH-L3-/-小鼠中UCH-L3 的缺失会导致骨骼肌中多聚泛素化蛋白大量增加并诱发应激反应[22]。同时，UCH-L3 的缺失会造成小鼠骨骼肌退化及发育受阻。上述研究表明去泛素化酶在肌肉发育分化中发挥了重要作用，但UCH-L3对牛肌肉发育分化是否具有调控作用还不清楚。本研究检测结果表明，分化前后牛骨骼肌卫星细胞中UCH-L3的表达量存在差异，提示UCH-L3 可能调控牛骨骼肌卫星细胞成肌分化；然后利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型，通过干扰UCH-L3 在牛骨骼肌卫星细胞中的表达，结果表明干扰UCH-L3 后分化形成肌管的数量少于对照组，肌管融合指数显著低于对照组，分化标志因子MyHC 的蛋白水平显著低于对照组。本研究表明UCH-L3 对牛肌卫星成肌分化非常重要，抑制UCH-L3 表达时抑制了牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。UCH-L3 在牛肌肉发育分化中与在小鼠中的作用相似，干扰UCH-L3 表达后牛肌卫星细胞中的肌管形成被抑制。