梅花入骨丹通过Toll样受体4/核转录因子-κB信号通路调节大鼠退变软骨细胞外基质代谢紊乱的作用机制

林家钟 黄艳峰 林翔 刘蔚楠 付长龙 刘献祥 王荣茂

【摘 要】目的：探讨梅花入骨丹通过Toll样受体4/核转录因子-κB（TLR4/NK-κB）信号通路调节退变软骨细胞外基质代谢紊乱的作用机制。方法：体外培养大鼠软骨细胞并鉴定，采用CCK-8法检测梅花入骨丹水提物（BCAE）对体外软骨细胞的增殖-毒性，筛选药物作用的最佳浓度和时间。采用10 ng·mL-1白细胞介素-1β（IL-1β）建立软骨细胞炎症退变模型，将软骨细胞分为空白对照组、模型对照组、BCAE组、抑制剂TAK-242组和抑制剂PDTC组，分别进行相应干预后，qRT-PCR及Western blot法检测各组基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、ColⅡ的mRNA、蛋白表达情况。结果：与空白对照组比较，模型对照组MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TLR4、IKKβ、p-p65的mRNA及蛋白的表达明显升高（P < 0.01），而IκBα、ColⅡ表达下降（P < 0.01）;与模型对照组比较，TAK-242组、PDTC组、BCAE组MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TLR4、IKKβ、p-p65的mRNA及蛋白的表达明显减少（P < 0.01），而IκBα、ColⅡ表达升高（P < 0.01）。结论：梅花入骨丹通过TLR4/NK-κB信号通路抑制MMPs的关键调控因子表达，从而抑制IL-1β介导的退变软骨细胞外基质代谢紊乱，发挥抗炎和保护软骨细胞的作用。

【关键词】 骨关节炎;梅花入骨丹;基质金属蛋白酶;软骨细胞;Toll样受体4;核转录因子-κB;信号通路

【ABSTRACT】Objective：To investigate the mechanism of Meihua Rugu Dan（梅花入骨丹）regulating extracellular matrix metabolism disorder of degenerative cartilage through TLR4/NK-κB signaling pathway.Methods：Rat chondrocytes were cultured in vitro and identified.CCK-8 method was used to detect the proliferation toxicity of BCAE on chondrocytes in vitro，and the optimal concentration and administration time of medicine were screened.Inflammatory degeneration model of chondrocytes were established with 10 ng·mL-1 of IL-1β.Chondrocytes were divided into a normal group，a model group，a BCAE group，a TAK-242 group and a PDTC group.After intervention，qRT PCR and Western blot methods were performed to detect the mRNA and protein expressions of MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，TLR4，IKKβ，IκBα，p-p65 and ColⅡ.Results：Compared with the normal group，the mRNA and protein expressions of MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，TLR4，IKKβ，p-p65 in the model group significantly increased（P < 0.01），while the expressions of IκBα and ColⅡ decr-eased（P < 0.01）.Compared with the model group，the mRNA and protein expressions of MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，TLR4，IKKβ，p-p65 in the TAK-242 group，PDTCgroup and BCAE group significantly decreased（P < 0.01），while the expression of IκBα and ColⅡ increased（P < 0.01）.Conclusion：Meihua Rugu Dan can inhibit the expression of key regulatory factors of MMPs through TLR4/NK-κB signaling pathway，thus inhibiting the metabolic disorder of extracellular matrix of degenerative cartilage mediated by IL-1β，playing an anti-inflammatory role and protecting chondrocytes.

【Keywords】 osteoarthritis;Meihua Rugu Dan（梅花入骨丹）;matrix metalloproteinase;chondrocytes;TLR4;NK-κB;signaling pathway

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的中老年关节退行性疾病。研究表明，软骨细胞赖以生存的细胞外基质（ECM）的合成与降解失衡是导致软骨退变的重要原因之一，基质金属蛋白酶家族（MMPs）在这一过程中起重要作用[1]。OA中存在多种MMP升高，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-13、MMP-14等。在OA發生过程中，多种信号通路参与ECM的降解及MMPs的表达调控，其中Toll样受体4/核转录因子-κB（TLR4/NK-κB）是近年来研究参与此过程的最重要通路之一[2]。OA滑膜中存在大量的NF-κB，在人关节软骨细胞内和软骨肉瘤细胞中，通过TNF-α或IL-1β的诱导，NF-κB可以调节由TNF-α或IL-1β介导的MMP-1、MMP-3、MMP-13基因和蛋白的表达[3-4]，对软骨基质及细胞因子的表达调控起着重要的作用。

梅花入骨丹为豆科羊蹄甲属多年生藤本植物，可以单味药或复方制剂给药，其性平、苦涩无毒，具有祛风除湿、活血止痛、健脾理气等功效，在福建闽东南地区长期用于治疗风湿性关节炎、OA、腰腿痛，疗效显著，具有很好的民间用药基础。研究表明，梅花入骨丹中所含的多种成分，如多糖、槲皮素、没食子酸等都能影响MMPs的表达[5-8]，因此推测其对MMPs的调控是发挥抗炎和保护关节软骨的重要作用机制。为进一步深入研究其作用机制，本课题从调节MMPs的主要信号通路——TLR4/NK-κB入手，以OA细胞模型为研究对象，采用Western blot、qRT-PCR技术深入研究其干预MMPs表达，保护关节软骨的机制，为后续的临床研究开发提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 4周龄SPF级SD雄性大鼠30只，体质量（90±5）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产合格证号SCXK（沪）2017-0005。由福建中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号SYXK（闽）2019-0007。实验动物给予自由饮水，标准饲料喂养。

1.2 实验试剂 梅花入骨丹药材（福建中医药大学附属人民医院中药房）;DMEM低糖培养基（美国Hyclone公司）;胎牛血清（杭州四季青公司）;质量分数为0.25%的胰蛋白酶（北京宝曼生物科技有限公司）;CollagenⅡ抗体（美国CST公司）;TritonX-100液（德国Merk公司）;RNA提取试剂盒（BIO BASIC INC公司）;反转录第一链DNA合成试剂盒、SYBR Green qPCR试剂盒（美国Fermentas公司）;CCK-8试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）;彩色预染蛋白marker（美国Thermo Fisher公司）;TAK-242、IL-1β试剂（福州沃森生物技术有限公司）;四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯（PDTC，江苏凯基生物技术有限公司）;TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13及ColⅡ抗体（美国Santa Cruz公司）;β-actin抗体（美国Abcam公司）;封闭用羊血清（北京索莱宝科技有限公司）;RIPA裂解液（强）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（福州沃森生物技术有限公司）;二抗：羊抗兔（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

2 方 法

2.1 大鼠膝关节软骨细胞的原代培养、传代培养和鉴定 取4周龄SPF级SD雄性大鼠膝关节软骨组织，Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞并进行原代和传代培养，差速贴壁法纯化软骨细胞，传代至第2代软骨细胞时，采用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及甲苯胺蓝染色鉴定纯化的软骨细胞。

2.2 梅花入骨丹水提物（BCAE）提取及母液制备 BCAE采用水回流提取，提取工艺为提取倍数12倍，常温浸泡30 min后，加热冷凝回流1.5 h，提取3次后过滤，滤液浓缩成浸膏，在冷冻机低温升华干燥24 h，最后制备成冻干粉。精确称取冻干粉50 mg，加入体积分数为10%的含FBS培养基5 mL混匀超声溶解10 min，再经0.22 μm无菌滤嘴过滤后制备成10 mg·mL-1 BCAE母液，4 ℃冰箱保存备用。

2.3 CCK-8法检测BCAE对体外软骨细胞的增殖-毒性 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入100 μL，使待测细胞密度至每孔5000个。体积分数为5%的CO2，37 ℃培养细胞24 h。加入10 μL不同浓度（0，10，50，100，500，1000 μg·mL-1）的BCAE，每组6孔，将培养板在培养箱分别孵育一段时间（24，48，72 h）。每孔加入10 μL的CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育4 h（根据前期预实验确定4 h为最佳），应用酶标仪，在450 nm双波长处测得各组相应OD值，结果导入Excel表进行细胞活力值计算，并绘制BCAE干预软骨细胞的时效量效曲线，筛选药物作用的最佳浓度和作用時间。

2.4 实验分组及处理 将纯化第2代软骨细胞接种于24孔板，并分为以下5组（每组6孔）：空白对照组、模型对照组、BCAE组、TAK-242组和PDTC组。空白对照组不加任何试剂;模型对照组加入10 ng·mL-1 IL-1β培养24 h;BCAE组预先加入相应剂量的BCAEmax培养1 h，再加入10 ng·mL-1 IL-1β培养24 h;TAK-242组预先加入10 μmol·L-1的TLR4特异性抑制剂TAK-242培养1 h，再加入10 ng·mL-1 IL-1β培养24 h;PDTC组预先加入10 μmol·L-1的NF-κB特异性抑制剂PDTC培养1 h，再加入10 ng·mL-1 IL-1β培养24 h。

2.5 qRT-PCR检测各组软骨细胞TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13及ColⅡ的mRNA表达 采用Trizol一步法常规提取软骨细胞总RNA，测定RNA样本浓度，逆转录。本实验引物序列采用Primer 5软件设计，引物序列见表1。反应体系：qRT-PCR SYBR Green Master Mix 10.5 μL;上游引物0.5 μL;下游引物0.5 μL;cDNA 2 μL;超纯水6.5 μL。反应条件：95 ℃ 5 min，预变性;95 ℃ 10 s，变性，60 ℃ 34 s，退火延伸，行40个循环扩增。同时注意扩增曲线趋势走向，以2-△△CT相对定量法计算各mRNA相对表达量。

2.6 Western Blot法检测各组TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13及ColⅡ蛋白表达情况 采用RIPA裂解液提取细胞蛋白，BCA法测样本蛋白浓度。吸取20 μg蛋白样品上样，经电泳、转膜后室温封闭1 h，弃封闭液，4 ℃下分别与TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ColⅡ和β-actin（1∶1000）一抗孵育过夜，用TBST洗膜;孵二抗（1∶2000），摇床室温孵育1 h，用TBST摇床洗膜;于ECL显影液下反应1 min，曝光、显影。用Image Lab软件分析获取各蛋白条带灰度值。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较采用t检验，不满足方差分析时采用非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠膝关节软骨细胞的原代培养、传代培养和鉴定 经Ⅱ型胶原酶机械消化获得SD大鼠软骨细胞，见图1（1）;原代软骨细胞培养7 d后，细胞长至90%，软骨细胞逐渐融合成单层，周围可见具有折光性细胞外基质，呈典型“铺路石”状，见图1（2）;原代细胞长满经传代培养后，软骨细胞中的杂质细胞比例逐渐减少，其中以第2代软骨细胞状态最佳，形态规则，胞核清晰，胞浆丰富，增殖速度快，纯化彻底，见图1（3）。Ⅱ型胶原染色鉴定结果显示，阳性对照组软骨细胞核清晰，呈蓝色，胞浆区被染为棕黄色，见图2（1），阴性对照组胞浆区不着色，见图2（2）;经甲苯胺蓝染色后，可见细胞核呈紫红色，见图2（3）。由此，可鉴定本实验所选用细胞符合典型的软骨细胞生物学特性。

3.2 药物作用的最佳浓度和作用时间 经不同浓度、不同时间干预后，细胞活力有较明显改变，在浓度上，0～100 μg·mL-1 BCAE均能促进细胞增殖，但100 μg·mL-1浓度细胞活力达最高值，呈稳定趋势;在时间上，BCAE干预24 h细胞活力达到最高值，促进细胞增殖作用最明显，与0 μg·mL-1比较，100 μg·mL-1 BCAE干预软骨细胞24 h差异有统计学意义（P < 0.01），见表2。因此，选用100 μg·mL-1作为BCAE组的干预浓度。

3.3 干预后各组软骨细胞TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ColⅡ的mRNA表达量比较 qRT-PCR结果显示，与空白对照组比较，模型对照组TLR4、IKKβ、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达显著上调（P < 0.01），而IκBα、ColⅡ mRNA表达显著下调（P < 0.01）;与模型对照组比较，BCAE、TAK-242、PDTC组TLR4、IKKβ、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9及MMP-13 mRNA表达呈显著下调趋势（P < 0.01），而IκBα、ColⅡ mRNA表达升高（P < 0.01）。见表3。

3.4 干预后各组软骨细胞TLR4、IKKβ、IκBα、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13及ColⅡ蛋白表达量比较 Western blot结果显示，与空白对照组比较，模型对照组TLR4、IKKβ、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白显著上调（P < 0.01），IκBα、ColⅡ蛋白表达显著下调（P < 0.01）;与模型对照组比较，BCAE、TAK-242、PDTC组TLR4、IKKβ、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表达显著下调（P < 0.01），而IκBα、ColⅡ蛋白表达显著上调（P < 0.01）。見表4、图3。

4 讨 论

OA的确切病因及发病机制尚不明确，目前认为力学和生物因素的影响是发病原因，软骨退变是发病根本，也是启动OA病理进程的首要因素。在正常情况下，关节软骨基质的合成、修复与降解可以维持一种平衡的状态，而当机体受到各种机械力学和生物化学等多种因素的影响后，软骨基质的这种平衡被打破[9]。在OA软骨及基质的转换过程中，MMPs起到重要作用。MMPs是一大类具有相似结构的锌离子依赖性内切蛋白酶，构成了ECM降解最重要的蛋白水解系统。研究表明，多种MMP参与OA的发生、发展，其中比较重要的有MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-13等，这些MMP主要由软骨细胞、滑膜细胞等分泌，可通过降解Ⅱ型胶原、蛋白多糖、基底膜成分、层粘连蛋白、纤维结合素等引起ECM降解，导致软骨退变[10-11]。

梅花入骨丹又名龙须藤，别名羊蹄藤、过岗圆龙、九龙藤、五花血藤、黑皮藤、梅花藤、乌郎藤、罗亚多藤等，主要分布在福建、江西、贵州、广东、广西、湖南、湖北等省。其主要含黄酮类、多糖、挥发油等成分，具有抗炎镇痛、抗菌、抗血小板聚集、清除自由基等作用[12]，可用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、胃脘胀痛等症，为我国多个少数民族的特色药。研究表明，梅花入骨丹乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位是梅花入骨丹抗炎镇痛、治疗类风湿关节炎的有效部位[13]。CAI等[14]研究梅花入骨丹多糖对大鼠膝关节软骨细胞的影响，发现其可促进软骨细胞增殖，从而改善软骨细胞损伤。陈海鹏等[15]使用以梅花入骨丹为主要成分的膝痛消方离子导入治疗轻中度膝OA，临床疗效显著。而在壮医中，基于解毒补虚的治则，采用龙须藤药方内服、熨烫及壮医药线点灸等多种手段相结合治疗风湿骨痛，如膝OA、类风湿关节炎等，疗效较好[16]。目前，对梅花入骨丹活性成分的分离及其抗炎的物质基础已有一定的研究，而对其治疗OA机制的研究国内外还甚少报道，因此，有必要对其治疗OA、抗炎及保护关节软骨的机制进行深入研究。

本研究以IL-1β诱导大鼠膝退变软骨细胞造模，IL-1β是OA发病过程中导致软骨基质降解和关节软骨破坏最主要的炎症因子之一，它能显著减少软骨细胞SOX9基因和蛋白表达，诱导软骨细胞凋亡;同时，通过促进软骨细胞分泌MMPs，引起软骨基质降解，加速软骨细胞分解代谢，最终导致软骨细胞退变。

本研究中，经BEAE干预IL-1β诱导的退变软骨细胞，与模型对照组比较，MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13基因及蛋白表达呈显著下调趋势（P < 0.01），而ColⅡ蛋白表达显著增高，说明梅花入骨丹能够通过调节MMPs的表达，降低基质降解，延缓软骨退变。为进一步深入研究其调控机制，实验检测BCAE干预IL-1β诱导的退变软骨细胞，上游信号通路TLR4/NK-κB相关因子的表达情况，结果表明，与模型对照组比较，BCAE能够下调软骨细胞TLR4、IKKβ、p-p65因子的表达，上调IκBα因子的表达，显示出与TLR4特异性抑制剂TAK-242和NK-κB的特异性抑制剂PDTC同样的作用效应。TLR4、IKKβ、p-p65是激活TLR4/NK-κB信号通路的关键因子，而IκBα能够抑制TLR4/NK-κB信号通路的表达。以上表明，梅花入骨丹可能通过影响上游信号通路TLR4/NK-κB中TLR4、IKKβ、p-p65及IκBα关键因子的表达，从而抑制软骨细胞MMPs的表达，进而抑制IL-1β介导的退变软骨细胞表达基质紊乱，发挥抗炎和保护关节软骨细胞的作用。

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收稿日期：2020-01-12;修回日期：2020-03-12