3株生防细菌间亲和性测定及其对苹果树腐烂病菌的抑制作用

2020-11-17李恩琛张树武徐秉良刘佳吉宝丽唐仕娟

甘肃农业大学学报 2020年5期

李恩琛，张树武，徐秉良，刘佳，吉宝丽，唐仕娟

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃兰州 730070)

中国是苹果生产第一大国，年产量稳居世界第一[1].截止2017年，我国苹果栽培面积达232.38万hm2，栽培规模世界第一[2].由于苹果病害的不断发生，尤其苹果树腐烂病(Valsamali)的发生，是目前苹果园内最严重的病害之一，对苹果的产量和品质都带来了不利的影响，导致果农经济损失严重，而且这种不利影响有日趋增加的态势，如不加以重视，将可能影响到苹果产业的发展[3].据相关研究报道，由于树龄老化，冻害，清园修剪不当，管理粗放等原因我国正在经历第5次苹果树腐烂病发病高峰[4].2008年曹克强等[5]对我国苹果主要产区进行了苹果树腐烂病的调查，结果显示，在所调查的果园中，苹果树腐烂病发病率达52.7%，并且有逐年加重的趋势.甘肃省作为全国苹果重要产区之一，近年来一直深受腐烂病的影响，果农损失严重，薛应钰等[6]对甘肃省主要苹果产区12个县的74个果园的腐烂病发生情况进行了调查，结果表明，在所调查的果园中苹果树腐烂病总体发病率为41.09%.

目前，对苹果树腐烂病的防治主要以化学防治为主，但长期使用化学合成农药不仅会杀死病原菌，而且会杀死有益微生物，破坏了农田生态系统平衡，对人类健康造成威胁、易使病原菌产生抗药性等一系列问题随之而来[7-9].生物防治具有对环境安全、低残留、不易产生抗药性、兼防兼治、促生等优势，是一种无公害植保新技术，所以利用微生物药剂防治苹果树腐烂病已成为目前研究热点之一[10-12].但是，相关学者研究认为，单一生防细菌菌剂在田间实际应用过程中存在一些劣势，如防效易受环境因素影响，单一菌株定殖能力差，适应能力低等，而亲和性好的生防菌株间混配使用可以产生协同增效的作用，会提高微生物防治的稳定性和广度[13].陈红等[14]研究表明，某些拮抗菌株混合后，其抑菌活性明显高于单一菌株，并能提高植物生长速率，且混合培养后单位含菌量有所提高.但关于芽孢杆菌用于苹果树腐烂病防治的研究报道较少，尤其芽孢杆菌间复配防治苹果树腐烂病更是未见报道.

本试验以苹果树腐烂病原菌为研究对象，测定了不同生防细菌及其复配组合的抑菌率，以明确生防细菌及其组合的的抑菌效果，为新型的微生物药剂的研制及田间应用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株供试病原菌：苹果树腐烂病菌Valsamali，由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室保存提供.

供试生防细菌：解淀粉芽孢杆菌TS-1203(TS-1203)Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢杆菌B1(B1)Bacillussubtilis、多粘类芽孢杆菌FS-1206(FS-1206)Paenibacilluspolymyxa，均由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室保存提供.

1.2 试验方法

1.2.1 单一生防细菌发酵菌液制备单一生防细菌发酵菌液的制备：在60 mL NB培养液中接种一环活化好的生防细菌，置于28 ℃、180 r/min的恒温摇床振荡培养12 h，获得种子液.在灭菌的NYBD(60 mL)培养基中接种3 mL生防细菌种子液，在28 ℃、180 r/min的恒温摇床振荡培养48 h后获得该生防细菌发酵菌液.

1.2.2 单一生防细菌发酵菌液对苹果树腐烂病菌的抑菌活性测定抑菌效果测定参考智小青等[15]采用的纸碟法和张静等[16]采用的菌丝生长速率法，对纸碟法略作修改.接种苹果腐烂病菌菌饼(d=5 mm)于平板中央，将分别蘸有单一生防细菌发酵菌液的圆形纸片(d=6 mm)放于距离中心位置2 cm的“十”字两端，共计4片，以蘸有无菌水的圆形纸片作为对照，置于25 ℃恒温培养箱中培养5～7 d后，采用十字交叉法测量病原菌菌落直径，每个处理和对照均重复3次.

1.2.3 不同生防细菌之间亲和性的测定各细菌菌株在NA培养基上生长48 h后，分别接种于装有60 mL NB培养液的三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min的恒温摇床振荡.振荡培养36 h后，取1 mL培养菌液稀释至108CFU/mL ，之后取稀释菌液200 μL用涂布器均匀涂抹于NA培养基上作为被测菌株；将直径为5 mm的无菌滤纸片放入另一培养菌液(1010CFU/mL)，浸泡5 s后取出作为测试菌株放入含有被测菌株的NA培养基上，每皿2片，放入培养箱中，28 ℃培养48 h之后观察两菌株间是否有抑菌圈出现(亲和性).各菌株培养菌液均作为测试菌株和被测菌株交叉测试，每个处理重复3次.

1.2.4 复配生防细菌发酵菌液制备复配生防细菌间发酵菌液的制备：在灭菌NYBD(60 mL)中加入不同比例生防细菌混合种子液3 mL(表1～2)，在28 ℃、180 r/min的恒温摇床黑暗振荡48 h后，可获得生防细菌发酵菌液.

表1 3种生防细菌种子液复配组合

1.2.5 不同生防细菌复配发酵菌液对苹果树腐烂病菌的抑菌活性测定抑菌效果测定采用纸碟法和抑制菌丝生长速率法.接种苹果树腐烂病菌菌饼(d=5 mm)于平板中央，将分别蘸有复配生防细菌发酵菌液的圆形纸片(d=6 mm)放于距离中心位置2 cm的“十”字两端，以蘸有无菌水的圆形纸片作为对照，并置于25 ℃恒温培养箱中培养5～7 d后，采用十字交叉法测量病原菌菌落直径，每个处理和对照均重复3次.

表2 FS-1206(或TS-1203)与B1种子液复配组合

1.2.6 B1、FS-1206及B1与FS-1206复配后生长曲线的测定采用比浊法[17-18]，将在NA培养基上活化的生防细菌B1、FS-1206接种于NB培养液中，置于28 ℃、180 r/min的恒温摇床振荡12 h，获得种子液，然后在灭菌NYBD(60 mL)中分别加入B1、FS-1206及B1与FS-1206混合(2∶1)种子液3 mL，继续在28 ℃、180 r/min的恒温摇床振荡培养.分别于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h时，取菌体培养液3 mL，用紫外分光光度计在600 nm下比色测定不同菌液的吸光值.以灭菌且未加种子液的NYBD培养液校零，每个处理重复3次.

1.3 数据处理

试验数据使用Microsoft Excel整理，并采用SPSS 19.0统计分析软件和Duncan氏新复极差法对数据进行方差分析及其差异显著性检验(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 单一生防细菌发酵菌液对苹果树腐烂病原菌的抑菌作用

3种生防细菌对苹果树腐烂病原菌的抑菌效果显著不同(图1和图2).由图1可以看出，TS-1203在3种生防细菌中对苹果腐烂病原菌的抑菌活性最低，抑菌率为68.35，FS-1206趋于中间，抑菌率为74.99%.B1对腐烂病病原菌抑制效果最好，抑菌率为80.41%，与FS-1206和TS-1203都呈显著性差异.

A:枯草芽孢杆菌B1； B：多粘类芽孢杆菌FS-1206； C:解淀粉芽孢杆菌TS-1203；D:CK.A:B.subtilis BS-1208；B：P.polymyxa FS-1206；C：B.amyloliquefaciens TS-1203.图2 单个生防细菌发酵菌液对苹果树腐烂病菌的抑制作用Figure 2 Bacteriostatic effect of single biocontrol bacterial fermentation broth on a Valsa mali

2.2 不同生防细菌间的亲和性

分别将不同生防细菌培养菌液作为被测菌株和测试菌株交叉测试，测定3种生防细菌间的亲和性，结果显示(图3)，B1无论作为测试菌株还是作为被测菌株，与多粘类芽孢杆菌FS-1206都表现为完全亲和(图3-A和图3-B).而枯草芽孢杆菌B1作为被测菌株时，与解淀粉芽孢杆菌TS-1203完全不亲和，两菌株间有明显抑菌圈产生(图3-C)，作为测试菌株时与TS-1203基本不亲和(图3-D).当TS-1203作为被测菌株时与FS-1206基本不亲和(图3-E)，而作为测试菌株时与FS-1206间产生明显抑菌圈，表现为完全不亲和(图3-F).综上可知，生防细菌菌株间的互作关系是多样化的，对一种生防细菌来说，其与另一种生防细菌的亲和性可能因条件不同而各异.

A：FS-1206作为被测，B1为测试菌株；B：B1作为被测，FS-1206为测试菌株；C：B1作为被测，TS-1203为测试菌株；D：TS-1203作为被测，B1为测试菌株；E：TS-1203作为被测，FS-1206为测试菌株；F：FS-1206作为被测，TS-1203为测试菌株.A：FS-1206 as the tested strain，B1 as the test strain；B：B1 as the tested strain，FS-1206 as the test strain；C：B1 as the tested strain，TS-1203 as the test strain；D：TS-1203 as the tested strain，B1 as the test strain；E：TS-1203 as the tested strain，FS-1206 as the test strain；F：FS-1206 as the tested strain，TS-1203 as the test strain.图3 3种生防细菌间的亲和性测定Figure 3 Determination of affinity among three biocontrol bacteria

2.3 复配生防细菌发酵菌液对苹果树腐烂病原菌的抑菌作用

由图4可知，TS-1203、FS-1206与B1以不同比例复配后发酵菌液对苹果树腐烂病菌的抑菌效果不同，当TS-1203、FS-1206与B1复配比例为2∶3∶1时，在所有复配比例中抑菌效果最好，抑菌率为78.14%，与其他复配比例抑菌率相比差异显著.而单一生防菌株B1发酵菌液对腐烂病原菌抑菌率达80.41%，显著高于3菌株所有复配比例，说明此3种生防细菌混合复配后对腐烂病菌的抑制效果无相加增效作用.

A：1∶1∶1；B：1∶2∶2；C：1∶3∶3；D：2∶1∶2；E：2∶2∶3；F：2∶3∶1；G：3∶1∶3；H：3∶2∶1；I：3∶3∶2；J：B1；K：FS-1206；L：TS-1203；图上不同小写字母表示经 Duncan氏新复极差法检验在0.05水平差异显著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.图4 3种生防细菌复配对苹果树腐烂病菌的抑菌作用Figure 4 Antibacterial effect of three biocontrol bacteria combinations on Valsa mali

由图5可知，当不亲和组合菌株TS-1203与B1复配比例为2∶3时，其复配发酵菌液对腐烂病病原菌抑制率为45.62%，显著高于其他复配比例.但TS-1203与B1复配后其任何比例下发酵菌液抑菌率都显著低于单一生防菌株.

A:1∶1；B:1∶2；C:1∶3；D:2∶1；E:3∶1；F:2∶3；G:3∶2；H:B1；I:TS-1203；图上不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在0.05水平差异显著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.图5 B1与TS-1203复配发酵菌液对苹果树腐烂病菌的抑制作用Figure 5 Inhibitory effect of mixed fermentation broth of B1 and ts-1203 on Valsa mali

将亲和组合菌株B1与FS-1206以不同比例复配，当B1与FS-1206复配比例为2∶1时，其复配发酵菌液对苹果树腐烂病菌抑制率达86.52%，显著高于单一菌株及其他复配比例(图6).

A:1∶1；B:1∶2；C:1∶3；D:2∶1；E:3∶1；F:2∶3；G:3∶2；H:B1；I:FS-1206；图上不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在0.05水平差异显著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.图6 B1与FS-1206复配发酵菌液对苹果树腐烂病菌的抑菌作用Figure 6 B1 and FS-1206 compound fermentation broth have bacteriostatic effect on Valsa mali

综上可知，B1、FS-1206、TS-1203 3种生防细菌不同组合、不同比例复配时，对苹果树腐烂病菌的抑制效果不同.B1、 FS-1206与TS-1203不同比例复配时，其所有复配比例发酵菌液抑菌率均显著低于单一生防细菌B1；B1与TS-1203不同比例复配时，其抑菌率都显著低于两种单一生防细菌发酵菌液；只有当亲和组合B1与FS-1206复配且复配比例为2∶1时对腐烂病原菌的抑制效果最好(图6)，与单一菌株相比能显著提高对腐烂病菌的抑菌活性.

2.4 B1、FS-1206及B1与FS-1206复配后生长曲线的测定

用紫外分光光度计在600 nm下分别比色测定B1、FS-1206及B1与FS-1206复配后不同菌液的吸光值，结果表明，3种菌液生长规律相似，在前16 h其生长速度缓慢，处于调整期，此时FS-1206的D600值为0.455，B1为0.656，B1∶FS-1206=2∶1D600为0.856；在NYBD培养液下发酵培养16 h后，菌株开始快速繁殖，各菌液浓度明显增加，进入生长对数期.在培养40 h后，FS-1206的D600值为1.940，B1D600值为2.182，B1∶FS-1206=2∶1复配菌液D600为2.682，其菌体生长开始趋于稳定.在培养48 h之后，各培养菌液吸光值开始下降，出现了菌体生物量减少的现象，进入菌体生长衰亡期.由图6可以看出，3种菌液在相同培养条件下，在48 h时其吸光值都达到峰值，FS-1206、B1及B1与FS-1206复配D600分别为1.962、2.238、2.725，说明生防细菌菌株B1与FS-1206以2∶1复配时其生长、菌体繁殖速率及菌体数量都要明显高于单一菌株.

图7 FS-1206、B1及B1和FS-1206混配生长曲线Figure 7 Growth curves of FS-1206，B1，and B1 and FS-1206

3 讨论

目前为止，大多数关于微生物防治植物病害的研究都还处于实验室阶段，其中限制生物防治稳定应用于田间的一个重要原因就是生防微生物在田间防治效果不稳定，受环境因素影响大.有研究表明，不同生防细菌具有不同的作用机制、不同生长需求、对环境不同的适应能力，所以将不同生防细菌菌株混合培养使用，可有效提高生物防治在田间的防效及稳定性[19-20].但不同生防细菌的混合使用并不一定能提高对病原菌的抑制效果，菌株间若存在拮抗性则会影响对植物病害的防效及稳定性，若混合使用的生防细菌菌株彼此间不产生拮抗性，表现亲和，那其混合使用后就能够在一定程度上提高对植物病害的防治效果[21-24].本试验选用的3种生防细菌均能对苹果树腐烂病菌产生拮抗作用，其中以B1对腐烂病原菌抑制效果最好.

本试验3株细菌菌株间亲和性测定结果表明，FS-1206与B1表现为完全亲和，其他两组组合间不亲和.将此3种生防细菌以不同组合不同比例复配后作用于苹果树腐烂病病原菌发现，完全亲和菌株B1与FS-1206以2∶1复配时，对苹果树腐烂病的抑菌效果最优，显著高于单一菌株.这说明不同拮抗菌株混合使用时，菌株间的不同作用机制和互作关系会对植物病害的防治效果产生影响，当生防细菌菌株间表现为完全亲和时，其混配使用对植物病害的防治效果会提高，这与陈志谊等[25]、傅莹等[26]的研究结果一致.本研究分别通过对FS-1206、B1及FS-1206与B1以2∶1混合各菌液生长曲线的测定，结果表明，两亲和性好的菌株FS-1206与B1复配后，其菌体生长速度、分裂繁殖速率、活菌菌体数量均显著高于单一生防细菌.所以，当两菌株间亲和性好，混合发酵培养时，单位含菌量会有所提高，并可能分泌多种拮抗物质，其混合作用于植物病害时可能不仅仅是简单的累加，而是有一定的协同增效作用，这与陈红等[ 25]、申爱荣等[15]的研究结果相似.