贯筋藤水提物对小鼠的镇静催眠作用

刘威良，黄艾祥

(云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201)

睡眠是人体不可或缺的生命活动之一，犹如进食、进水一样是一个主动的生理与心理过程，并非疲劳引起的结果[1].国际上公认的健康标准包括适量的运动、饮食的均衡及充足的睡眠，其中睡眠时间占人类一生的三分之一，其对人体健康的维持至关重要.随着社会的高速发展，生活压力剧增，生活节奏加快，生活习惯的不规律，导致失眠的发病率呈逐年上升且趋于低龄化，这一问题引起国内外医学界的关注.失眠是指不能正常获取睡眠的一种病症，临床上较为常见并且难以根治，其发生受诸多因素的影响，但均表现为机体正常睡眠-觉醒节律的紊乱，继而引发神经-内分泌-免疫功能异常，危害人们的身心健康[2].国内外流行病学调查研究表明，平均每3个成年人中存在一人饱受睡眠障碍的困扰，我国大约45.5%的人群存在不同程度的睡眠问题[3].

目前临床上治疗失眠主要依赖于化学类药物，如苯二氮卓类；褪黑素类受体激动剂催眠药；非苯二氮卓类及某些有镇静作用的抗抑郁药物等.这些药物均可通过介导相关神经递质发挥中枢镇静作用，但易于产生成瘾性、戒断症状明显及药物依赖性等不良副作用[4].相比西药，中药有着毒副作用小、疗效高等优点，加上我国植物资源丰富，近年来研究发现，一些药食同源植物对人体免疫、内分泌、生殖系统疾病等表现出良好的防治作用外，对中枢神经系统亦表现出很好的生理功效，如酸枣仁提取物可通过5-羟色胺能神经系统(5-HTergic)发挥镇静催眠作用，灵芝提取物可通过γ-氨基丁酸能神经系统(GABAergic)促进睡眠，如今，研究重心逐步转向从一些药食同源植物提取物中寻找治疗失眠的功能因子[4-7].

苦绳(Dregeasinensis)又称“小木通、奶浆藤、通关散”，属萝藦科(Ascle piadaceae)南山藤属(DregeaE.Mey.)野生植物资源，广泛分布于四川、广西、贵州、云南等地区的山岭地带，至今未见人工培育的种苗[8].贯筋藤为苦绳的一个变种，广泛分布于云南西北地区的澄江、丽江、大理和昆明等地的灌木丛或山林中.贯筋藤浑身是宝，其各个器官用热水蒸煮浸泡后的溶液，可用来制作云南大理一种特色小吃“乳扇”，其鲜叶、花蕾可与辣椒面、豆豉等风味调料一起搭配烹饪食之[9].贯筋藤的干茎是我国傣族医药(傣百解胶囊)的一味药材，用于治疗痈疮疖肿，风湿弊痛，咳嗽痰喘等病症[10].古代医药专著记载贯筋藤可祛风湿止痛、平喘止咳、通经下乳，用以医治风湿痹痛、肺热咳喘、跌打损伤、小儿惊风抽搐等病症[11].现代药理学研究表明，贯筋藤富含黄酮、多糖、甾体皂苷及蛋白质等活性成分，其生理功效有抗抑郁、抗癫痫、抗糖尿病、神经保护、肝保护、免疫调节及抗癌等[12-14].目前对贯筋藤的研究多集中于其活性物质的萃取、分离及结构鉴别等方面[15-17].国内学者黄艾祥等[18]研究发现，贯筋藤中的蛋白酶类物质是一种天然、高效及安全的凝乳剂，可用于食品加工，工业絮凝剂生产等.有关贯筋藤镇静催眠作用的研究未见报道，本试验采用相关药理学研究模型，初步探讨贯筋藤水提物对小鼠的镇静催眠作用，为其改善睡眠功能性食品、药品、保健品的研发提供科学依据，并拓展资源的利用空间.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品 贯筋藤鲜茎采自云南丽江永胜县，海拔1 500～3 500 m灌木丛或山林中.

1.1.2 试验动物 SPF级ICR小鼠，雄性，体质量18～22 g，采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证为：SCXK(湘)2016-0002.

1.2 试验试剂及仪器

1.2.1 试验试剂 戊巴比妥钠(Sigma，上海化学试剂分装厂进口分装，批号：F20160721)；艾司唑仑片(华中药业股份有限公司，批号：20180605)；戊四氮(天津希恩思生化科技有限公司，批号：20180915)；士的宁(四川维克奇生物科技有限公司，批号：20180712)；印防己毒素(上海麦克林生化科技有限公司，批号：20180823)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20170909)；二甲基亚砜(Sigma，批号：D2650)；生理盐水(广州市鸿洲实验器材科技有限公司，批号：20181107)；所用其他试剂均为分析纯.

1.2.2 试验仪器 YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(济南益延科技发展有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；RE520旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；Scientz-500C多功能恒温超声萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；400Y多功能粉碎机(浙江永康市铂欧五金制品有限公司)；CP153电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；LC-162C海尔冰箱(青岛海尔集团)；秒表(深圳市惠波工贸有限公司).

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备 贯筋藤水提物：称取1 kg贯筋藤干茎，粉碎，加入20倍体积的蒸馏水，100 ℃回流提取3次 ，每次2 h,过滤、离心，合并3次滤液，上旋转蒸发仪浓缩至相当于原生药量1 g/mL的药液，分装于无菌试管中，-20 ℃冰箱冷冻保存备用，待使用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成悬浮液[19].

1.3.2 对小鼠自发活动的影响[20]按照《中药新药临床研究指导原则 》剂量选择的方法，将人用剂量折算成小鼠给药剂量，将小鼠随机分为5个组，确保组间体质量无显著性差异(P>0.05)，每组11只小鼠，即贯筋藤水提物高剂量组(2 g/kg)、中剂量组(1 g/kg)、低剂量组(0.5 g/kg)、艾司唑仑片组(2 mg/kg)、空白组，各组均灌胃给药，其中空白组灌胃给予0.5%的羧甲基纤维素钠溶液(给药量为20 mL/kg).每日灌胃一次，每日上午8∶00～10∶00给药，连续给药7 d，给药期间观察各组小鼠精神状态、皮毛色泽、饮食与粪便有无异常，于末次给药后30 min，将小鼠放入自主活动记录仪的小室内，适应环境3 min，然后用自主活动仪连续记录5 min内小鼠自主活动次数.为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.3 对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠作用的影响[21]

1.3.3.1 对阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠率的影响 取55只小鼠，分组给药，方法同1.3.2.末次给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液阈下剂量(30 mg/kg)，以小鼠翻正反射消失1 min以上者则记为入睡，观察并统计注射戊巴比妥钠后15 min内各组小鼠的入睡百分比.为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.3.2 对阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响 取55只小鼠，分组给药，方法同1.3.2.末次给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠溶液阈剂量(50 mg/kg)，用秒表观察并记录小鼠睡眠潜伏期(从注射戊巴开始至小鼠翻正反射消失的时间)和睡眠持续时间(从小鼠翻正反射消失至恢复正常活动的时间).为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.4 对戊四唑诱导惊厥的影响[22]取55只小鼠，分组给药，方法同1.3.2.末次给药30 min后腹腔注射戊四唑溶液(85 mg/kg)，观察并记录各组小鼠惊厥及死亡情况.为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.5 对印防己毒素诱导惊厥的影响[23]取55只小鼠，分组给药，方法同1.3.2.末次给药30 min后腹腔注射印防己毒素溶液(10 mg/kg)，观察并记录各组小鼠惊厥及死亡情况.为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.6 对士的宁诱导惊厥的影响[24]取55只小鼠，分组给药，方法同1.3.2.末次给药30 min后腹腔注射士的宁溶液(1.6 mg/kg)，观察并记录各组小鼠惊厥及死亡情况.为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 对小鼠自主活动的影响

本研究显示，连续给药7 d后，与空白对照组比较，艾司唑仑组明显抑制小鼠的自主活动次数，且具有非常显著的差异(P<0.001)；贯筋藤水提物高、中、低剂量组均能不同程度抑制小鼠的自主活动次数，且有统计学差异(P<0.05)，表明其具有一定的中枢镇静作用；与艾司唑仑组比较，贯筋藤水提物各剂量组均无统计学意义，结果见表1.

表1 贯筋藤水提物对小鼠自主活动的影响

2.2 对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠作用的影响

2.2.1 对阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠率的影响 本研究显示，连续给药7 d后，与空白对照组比较，艾司唑仑组明显增加阈下剂量戊巴比妥钠所致的睡眠小鼠的数量，且具有统计学差异(P<0.01)；贯筋藤水提物高、中、低剂量组均能不同程度的增加阈下剂量戊巴比妥钠所致的睡眠小鼠的数量，且具有统计学差异(P<0.01)，表明其对戊巴比妥钠诱导的睡眠有一定的协同作用，结果见表2.

表2 贯筋藤水提物对戊巴比妥钠阈下剂量催眠小鼠的影响

2.2.2 对阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响 本研究显示，连续给药7 d后，与空白对照组比较，艾司唑仑组明显缩短阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠的入睡潜伏期时间，延长小鼠睡眠时间，且具有非常显著的差异(P<0.001)；贯筋藤水提物各剂量组均能不同程度地缩短阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠的入睡潜伏期时间，且具有统计学差异(P<0.05)，同时明显延长小鼠睡眠时间，且具有非常显著的差异(P<0.001)，表明其具有协同戊巴比妥钠促进动物睡眠的效果，结果见表3.

表3 贯筋藤水提物对阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响

2.3 对戊四唑诱导惊厥的影响

本研究显示，连续给药7 d后，与空白对照组比较，艾司唑仑组明显降低戊四氮致惊厥小鼠的死亡率，且具有统计学差异(P<0.01)；贯筋藤水提物各剂量组均能不同程度地降低戊四氮致惊厥小鼠的死亡率，且具有统计学差异(P<0.01)，表明其对中枢兴奋剂戊四唑有一定的拮抗作用，结果见表4.

表4 贯筋藤水提物对戊四唑诱导小鼠惊厥的影响

2.4 对印防己毒素诱导惊厥的影响

本研究显示，连续给药7 d后，与空白对照组比较，艾司唑仑组明显降低印防己毒素诱导小鼠惊厥的死亡率，且具有统计学差异(P<0.01)；贯筋藤水提物各剂量组均能不同程度地降低印防己毒素致惊厥小鼠的死亡率，且具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，表明其对中枢兴奋剂印防己毒素有一定的拮抗作用，结果见表5.

表5 贯筋藤水提物对印防己毒素诱导小鼠惊厥的影响

2.5 对士的宁诱导惊厥的影响

本研究显示，连续给药7 d后，与空白对照组比较，艾司唑仑组明显降低士的宁诱导小鼠惊厥的死亡率，且具有统计学差异(P<0.01)；贯筋藤水提物各剂量组均能不同程度地降低士的宁致惊厥小鼠的死亡率，且具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，表明其对中枢兴奋剂士的宁有一定的拮抗作用，结果见表6.

表6 贯筋藤水提物对士的宁诱导小鼠惊厥的影响

3 讨论

失眠是困扰现代人最长见的病症之一，其发病率呈逐年上升趋势，且趋于低龄化.一些药食同源植物提取物因其毒副作用小及在镇静催眠方面表现出良好的效果，备受广大研究者们青睐[25].

睡眠是一个涉及多系统、多中枢、较为复杂的生理过程，长期以来人们对镇静催眠类药物研究的方法不尽相同，但大体上趋向一致，其中动物自主活动试验是评估精神类药物最为常用、方便的试验方法，它能很好地反映中枢神经系统功能状态(兴奋或抑制)，是一项重要的检测指标[26].本试验结果表明，贯筋藤提取物不同剂量组均能显著减少小鼠自主活动，可降低大脑皮层兴奋性，具有一定的中枢镇静作用，且呈现出量效关系.戊巴比妥钠是巴比妥类催眠药，常应用于动物麻醉试验中，其作用机制与GABAA受体有关，药理学试验研究中常利用药物与戊巴比妥钠的协同作用来评价镇静催眠作用情况[27].戊巴比妥钠主要通过肝药酶进行代谢，若所筛药物对肝药酶有抑制作用，也可以延长戊巴比妥钠所致实验动物的睡眠时间，因此，采用戊巴比妥钠阈下剂量进行实验排除此类影响[28].本研究数据显示，贯筋藤水提物不同剂量组均能明显提高小鼠的入睡率、显著缩短阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期并延长其睡眠持续时间，具有协同戊巴比妥钠催眠作用，且呈现出剂量依赖关系，其发挥镇静催眠作用的机制可能与GABAA受体有关.甘氨酸(Glycin)和γ-氨基丁酸(GABA)是大脑内重要的抑制性氨基酸，其对中枢神经系统兴奋与抑制稳态平衡发挥着重要调控作用[29].戊四唑，又称戊四氮，是GABA受体拮抗剂，主要的作用部位是脑干和大脑，增强兴奋性突触的易化过程，引发惊厥的产生，临床上主要用于解救麻醉药及巴比妥类药物中毒，动物实验中常作为一种惊厥反应的诱导剂[30].印防己毒素是一种非竞争性离子通道阻断剂，作用于GABAA受体，剂量过大可导致大脑中枢神经和脊髓神经过度兴奋引发惊厥，临床上用于解救巴比妥类药物中毒，属于作用偏强的中枢兴奋剂[31].士的宁又称番木鳖碱，是从我国传统中药马钱子中提取出来的一种生物碱，为中枢神经系统内抑制性氨基酸甘氨酸(Glycin)受体拮抗剂，其通过选择性阻断Glycin受体，提高骨骼肌的紧张度，剂量过大时可诱导强直性惊厥的发生，临床上用于治疗弱视、偏瘫、巴比妥类药物中毒、血液病以及链霉素的毒性反应[32-33].本试验数据显示，贯筋藤提取物各剂量组均能不同程度地降低不同药物诱导小鼠惊厥的死亡率，且具有统计学差异，表明其可能通过作用于Glycinergic及GABAergic通路，发挥中枢镇静作用，具体作用机制有待进一步考察.

4 结论

综上所述，本研究采用小鼠自主活动、药物与戊巴比妥钠协同作用及对抗中枢兴奋剂等经典的镇静催眠模型综合评价药物的中枢镇静作用，初步考察了不同给药剂量的贯筋藤提取物对小鼠镇静催眠及对抗中枢兴奋剂诱导的惊厥作用，结果表明其能够降低正常小鼠的自发活动、对戊巴比妥钠促进动物睡眠有一定的协同促进作用、对各种致惊厥剂诱导的惊厥反应有很好的对抗效果，这可能与其富含黄酮、皂苷等活性成分通过多靶点、多途径发挥中枢镇静作用有关，具体是哪一种活性成分发挥作用及其促睡眠机制有待后期考察.