基于数字PCR方法的新型冠状病毒检测

周阳 费明明 黄左安

摘要：荧光定量PCR（RT-PCR）检测方法作为检测SARS-CoV-2的金标准被广泛应用于临床。但由于标本病毒载量不同和RT-PCR的局限性，不可避免的会出现大量的假阴性报告，导致无法及时诊断、早期治疗、阻断传播、评估出院标准等问题。为了改善这一情况，我们探索了一种基于数字PCR（ddPCR）技术的检测SARS-CoV-2的方法。首先，使用新型冠状病毒数字PCR核酸检测试剂盒定量三例强阳咽拭子样本ORF1ab基因拷贝数，并与RT-PCR的Ct值进行分析，发现二者呈对数相关性。随后挑选1例阳性样本，进行倍比稀释检测，最终确定其检测试剂盒的最低检出限为250 copies/ml，远低于RT-PCR的1000 copies/ml。使用60例稀释至250 copies/ml对试剂盒检出限进行验证，发现ORF1ab基因检出率为93.3%，N基因检出率为100%。临床验证结果显示在检测的15例临床样本，其中8例RT-PCR诊断为疑似的样本，ddPCR结果5例是阳性，3例是阴性。因此，ddPCR在临床诊断SARS-CoV-2具有更高的灵敏度，减少了假阴性和假阳性诊断，对COVID-19诊断、治疗和防控等方面均具有重要意义。

关键词：SARS-CoV-2;COVID-19;核酸检测;RT-PCR;ddPCR

【中图分类号】R563.1  【文献标识码】A  【文章编号】1673-9026（2020）08-217-03

1.引言

2019年12月，湖北武汉爆发不明原因肺炎，并迅速在全国蔓延。目前，COVID-19的检测主要有CT检查[1]，核酸检测[2，3]和抗体检测[4-6]。荧光定量PCR已经成为实验室检测SARS-CoV-2病毒核酸的主要方式[7]，然而，核酸检测结果受到样本和取样时间的影响，存在假阴性情况[3，8，9]，原因之一可能是样本的病毒载量未达到试剂的最低检出限。寻找具有更低检出限的核酸检测方法，成为了临床检测COVID-19的重要目标。

微滴式数字PCR（ddPCR）是一种将模板稀释到单分子水平并结合泊松分布定量DNA分子的方法[10]。与实时荧光定量PCR相比，它提供了更高的灵敏度和特异性。因此，本研究基于ddPCR技术，评估了RT-PCR检测与ddPCR检测新冠病毒的灵敏度与特异性，确定一种高灵敏的检测方法，以期降低臨床检测的假阴性率。

2.材料方法

2.1材料

鼻咽拭子样本共118份，其中阴性样本101份，阳性样本9份，疑似样本8份，由中国科学院大学宁波华美医院提供;核酸提取或纯化试剂（Ex-DNA/RNA病毒）、全自动旋转式核酸提取仪（GeneRotex 96）购自苏州天隆生物科技有限公司;数字PCR微滴式芯片（V2）、新型冠状病毒核酸检测试剂盒（数字PCR法）、样本制备仪（DG32）、PCR扩增仪（TC1）、生物芯片阅读仪（iScanner5）由领航基因科技（杭州）有限公司提供。新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）购自上海伯杰医疗科技有限公司。全自动定量PCR仪（SLAN-96S）购自上海宏石医疗科技有限公司。

2.2实验方法

2.2.1核酸提取

取出-80℃冰箱保存的鼻咽拭子样本，室温融化，涡旋震荡混匀。取出核酸提取和纯化试剂，将深孔板颠倒混匀，重悬底部磁珠，轻甩孔板，使试剂及磁珠集中到底部，撕开封口膜。深孔板第一孔加入20ul蛋白酶K和200ul鼻咽拭子样本，第二孔放入搅拌套。加完样本后的孔板放入全自动旋转式核酸提取仪中，按照说明书的程序提取病毒核酸。取出最后一孔中的核酸样本到1.5ml无RNA酶的EP管中，-80℃保存。

2.2.2数字PCR扩增及芯片阅读

预热样本制备仪、生物芯片阅读仪。取出-20℃冰箱保存的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（数字PCR法），冰上溶解ddPCR试剂。在生物安全柜中按照说明书配制反应体系，取14ul反应体系加入到数字PCR微滴式芯片进样口的杯子中，加入16ul油相补满。在进出口杯子上盖上硅胶帽，放入样本制备仪制备微滴。微滴制备完成后，将芯片放入PCR扩增仪中，按照程序扩增。取出扩增完成的芯片，放入生物芯片阅读仪扫描并记录结果。

2.2.3RT-PCR扩增

取出-20℃冰箱保存的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），冰上溶解RT-PCR试剂。在生物安全柜中按照说明书在八连管中配制反应体系。将八连管放入全自动定量PCR仪中，按照程序扩增并观察结果。

2.2.4阳性样本定量

挑选3个qPCR检测结果为强阳性的样本，用阴性稀释液稀释阳性样本的核酸，梯度为1，10，100倍稀释。取200ul样本，使用核酸提取或纯化试剂提取样本核酸，重复2次。提取的核酸进行数字PCR ORF1ab单基因定量，计算原始样本病毒拷贝数。

计算公式：

Y：原始样本病毒核酸拷贝数;D：稀释倍数;S：提取样本量;E提取后核酸体积;T：反应核酸体积;R：反应体系体积;Q：定量拷贝数。

2.2.5线性化验证

取2.2.5的阳性核酸样本，直接进行RT-PCR检测。通过GraphPad软件对数据进行线性分析，X为RT-PCR检测的Ct值，Y为Log10ddPCR定量的核酸数值，P < 0.05认为有意义。

2.2.6最低检出限确定

取1例定量后的阳性样本，用阴性稀释液，采用倍比稀释法将样本核酸拷贝数稀释到2000，1000，500，250 copies/ml，各三份。使用核酸提取或纯化试剂提取各样本核酸并收集。提取的核酸样本使用数字PCR核酸检测试剂盒进行ORF1ab和N基因双基因扩增检测。根据检出结果，确定最低检出限。

2.2.7最低检出限验证

取3例定量后的阳性样本，用阴性稀释液稀释到最低检出限的基因拷贝数，各20份。核酸提取或纯化试剂提取样本核酸并收集，使用数字PCR核酸检测试剂盒进行ORF1ab和N基因双基因扩增检测。检出率 > 90% 则认为该拷贝浓度是最低检出限。

2.2.8临床样本验证

取15例RT-PCR检测后的样本，1例为阴性，6例为阳性，8例为疑似阳性。样本核酸使用ddPCR进行OFR1ab和N基因双基因扩增检验，观察检出效果。

2.3实验结果

2.3.1阳性样本定量结果

以10倍稀释的样本ORF1ab检出数值预估原样本的浓度。样本A为7.5×106 copies/ml;样本B为1.1×107 copies/ml;样本C为3.0×107 copies/ml。

2.3.2线性化验证

提取的核酸进行RT-PCR检测，以Log10拷贝数和RT-PCR的Ct值进行比对，通过GraphPad软件分析二者结果是否呈线性相关，如图1所示。

从图1可以看出，ddPCR定量的SARS-CoV-2病毒ORF1ab拷贝数与RT-PCR检测的Ct值线性相关，且p值小于0.0001。

2.3.3最低检出限确定及验证

样本在2000，1000，500 copies/ml时，两个基因的检出率为100%，250 copies/ml，有一個样本的ORF1ab基因未检测到。因此最低检出限在500copies/ml和250 copies/ml两个浓度中产生。

取ABC三个样本，用阴性稀释液稀释到250 copies/ml，各20份样本，进行核酸提取和数字PCR检测，结果见表1。N基因的检出率为100%，ORF1ab的检出率为93.3%。可以确定该试剂盒的最低检出限为250 copies/ml。

2.3.4临床样本验证

取RT-PCR检测阳性，弱阳性，阴性样本共15例，进行ddPCR检测，见表2。样本1 RT-PCR和ddPCR检测都为阴性;样本2-7，二者都为阳性，样本8-10 RT-PCR结果为疑似，ddPCR结果为阴性。样本11-15 RT-PCR结果为疑似，ddPCR结果为阳性，结果见表2。

2.4讨论

本研究使用领航基因生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（数字PCR法）以及相配套的仪器，对3例阳性病人鼻咽拭子样本进行绝对定量。通过对比ddPCR定量结果和RT-PCR的Ct值确定二者呈线性相关（图1）。随后，选取1例阳性样本进行梯度稀释，测得ddPCR最低检出限为250 copies/ml，并用其他2例样本进行验证，ORF1ab基因检出率为93.3%，N基因检出率为100%。目前市场上的RT-PCR试剂盒检出限基本为1000 copies/ml[11]，但患者的许多样本病毒含量达不到该检出限[12]。另外，笔者对15例样本进行临床样本，表2的结果显示有8例RT-PCR结果为疑似的样本，其中5例样本ddPCR的结果为阳性，3例为阴性，这表明ddPCR在检测低病毒载量样本方面更具有优势，减少假阴性和假阳性结果。这也与Suo[13]和Yu[14]等人的研究结果一致。随着新冠疫情在全球愈演愈烈，国际对于新型冠状病毒核酸检测试剂盒需求急剧上升。

越来越多基于RT-PCR的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒被开发并上市，以满足临床大规模分子诊断的需要。目前为止，RT-PCR仍是COVID-19确诊的金标准，但是，受限于检测灵敏度不足，在检测病毒含量低的样本时无法检出信号，常导致假阴性的诊断结果[15]。目前市面上新冠核酸数字PCR试剂盒仅限用于科研，还未用于临床诊断。本研究中对比了RT-PCR和ddPCR两种检测方法对于SARS-CoV-2的检测灵敏度，研究表明，ddPCR能够检出相对较低的病毒载量样本，因此，在新冠病毒的检测中，利用ddPCR技术，能够有效降低样本假阴性和假阳性的产生，是核酸检测的一个重要补充方法，对COVID-19的确诊以及后续治疗效果验证具有重要意义。

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作者簡介：周阳：硕士，中国科学院大学宁波华美医院

*通讯作者：张顺，蔡挺

资助项目华美基金，项目编号2020HMZD28;基于数字PCR技术的新型冠状病毒（COVID-19）高灵敏诊断平台，2020YJY0205