白头翁汤有效成分提取工艺和含量测定

吴柯楠 唐志书 梁艳妮 吉帆 于金高 张珍 张东博 王征

摘要 [目的]优选白头翁汤提取工艺。[方法]以浸膏得率、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、秦皮素、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4含量为考察指标，以提取溶剂、料液比、提取时间为考察因素，采用单因素试验和正交试验优选提取工艺，运用HPLC法对白头翁汤中提取成分（秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、秦皮素、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4）进行含量测定，并进行综合评分。[结果]最佳提取工艺为8倍60%乙醇为溶剂，提取3 h。[结论]优选的提取工艺合理、可行。

关键词 白头翁汤;正交试验;有效成分;提取工艺;含量测定

中图分类号 R284  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）20-0184-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.049

Extraction Process and Content Determination of Active Components in Pulsatilla Decoction

WU Ke-nan 1，2，TANG Zhi-shu 1，2，LIANG Yan-ni 1，2 et al （1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Xianyang，Shaanxi 712083;2.State Key Laboratory of Research and Development on Characteristic Resources of Qin Medicine Jointly Built by the Ministry and the Province （Cultivation），Xianyang，Shaanxi 712083）

Abstract [Objective]To optimize the extraction technology of pulsatilla.[Method]The extraction technology of pulsatilla decoction was optimized by single factor experiment and orthogonal design with the concentration of alcohol，the amount of solvent， the extraction time as factors，taking extractum yield， the contents of aesculin， aesculetin， phellodendron， quercetin， berberine hydrochloride and pulchinenoside B4 as indicators.The content of extracts from pulsatilla chinensis （aesculin， aesculetin， phellodendron， fraxetin， berberine hydrochloride and pulchinenoside B4） was determined by HPLC. The quality of the pulsatilla soup was evaluated.[Result]The optimal extraction process was as follows：adding 8 times amount of 60% alcohol and extracting for 3 hours.[Conclusion]The optimal extraction technology is reasonable and practical.

Key words Pulsatillae decoction;Orthogonal test;Active ingredient;Extraction process;Content determination

白頭翁汤始载于《伤寒论·厥阴篇》，是中医临床常用的经典方剂，主要用于治疗热痢下重者。由白头翁、黄柏、黄连和秦皮4味中药组成 [1]。方中白头翁为君药，归大肠与肝经，味苦性寒 [2]，具有清热解毒、凉血止痢的功效。臣以黄连之苦寒，清热解毒，燥湿厚肠;黄柏泻下焦湿热，与黄连共助君药清热解毒之效，尤能燥湿止痢。秦皮归大肠经，苦寒性涩，主热痢下重。以上四药合用，共奏清热解毒、凉血止痢之功效 [3]。

在中华中医药学会脾胃病分会发布的“溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）”中，明确将溃疡性结肠炎归属于中医“久痢”的范畴 [4]。同时，在辨证论治中明确白头翁汤是热毒炽盛证的主要方剂。由此可见白头翁汤对溃疡性结肠炎具有显著的治疗作用 [5]。现代药理作用研究表明，白头翁汤具有显著的抗炎作用，且与抑制cAMP-PDE的活性、升高cAMP含量密切相关 [6]。同时研究表明，白头翁汤对阴道念珠菌 [7]、白色念珠菌、伤寒沙门氏菌 [8]、金黄色葡萄球菌等均有一定的抑制作用 [9]。白头翁汤中含有多种化学成分，包括生物碱类、柠檬苦素类、香豆素类、皂苷类、木脂素类等化学成分 [10]。笔者将进一步对白头翁汤有效成分最优提取工艺进行优化，并建立HPLC同时检测其中不同化学成分含量的方法，为白头翁汤进一步的研究提供支撑 [11]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。白头翁（生产批号20180801）、黄连（生产批号20170401）、黄柏（生产批号20181001）、秦皮（生产批号20181201），以上药材均购自陕西兴盛德药业有限责任公司，经陕西中医药大学中药资源产业化省部共建协同创新中心李铂老师鉴定为正品药材。秦皮甲素（生产批号17072801）、秦皮素（生产批号17041703）、黄柏碱（生产批号18110801），以上3种对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司;秦皮乙素（生产批号wkq18050209）、白头翁皂苷B4（生产批号wkq19013009）、盐酸小檗碱（生产批号wkq19013111），以上3种对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器。超高效液相色谱仪（岛津LC-20ADXR），FW-1000AD型高速万能粉碎机，FA2004B型电子天平，101型电热鼓风干燥箱，MH-1000型可调式电热套，KQ-300DE型超声波清洗器，超纯水仪。

1.1.3 主要试剂。色谱甲醇、色谱乙腈，均购自赛默飞世尔科技公司;色谱磷酸，购自天津市科密欧化学试剂有限公司;超纯水为实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验。每组试验称取处方量的1/10，放置电热套上回流提取。分别选取提取溶剂、提取时间、料液比3个因素进行单因素试验 [12-13]，以浸膏得率为初步评价标准，确定各因素范围。

1.2.2 正交试验。在单因素试验的基础上，分别选取提取溶剂60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和纯水，溶剂用量7倍、8倍、9倍和10倍，提取时间1、2、3、4 h，以浸膏得率和活性成分秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、盐酸小檗碱、黄柏碱和白头翁皂苷B4含量为评价指标，进行3因素4水平L 16（43）正交试验设计 [14-15]，考察提取时间、提取溶剂和料液比对上述指标的影响。

1.2.3 对照品溶液的制备。精密称取秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、秦皮素、盐酸小檗碱2 mg，精确量取10 mL甲醇-水溶液（1∶1），配制成浓度为0.2 mg/mL的溶液;精密称取白头翁皂苷B4 2 mg，精确量取2 mL甲醇-水溶液（1∶1），配制成濃度为1 mg/mL的溶液。将以上配制溶液超声10 min，分别用0.22 μm微孔膜过滤，备用。

1.2.4 供试品溶液的制备。精密称取正交试验所得16组样品各10 mg，精确量取10 mL甲醇-水溶液（1∶1），分别配制成浓度为1 mg/mL的溶液，超声10 min，用0.22 μm微孔膜过滤，取续滤液，备用。

1.2.5 色谱分析条件。采用Accucore C 18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）色谱柱，在柱温30 ℃下以乙腈-0.5%磷酸为洗脱剂进行梯度洗脱，每次进样量3 μL，流速0.4 mL/min，检测波长210 nm。梯度洗脱（0～5 min，4%乙腈;6～15 min，10%乙腈;16～28 min，30%乙腈;29～32 min，95%乙腈;33 min，5%乙腈） [3，16]。

1.2.6 方法学考察。

1.2.6.1 线性关系的考察。将秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、秦皮素、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4分别配制成2.67、5.30、11.00、13.30、26.70、40.00、53.00、66.70、80.00 μg/mL的标准系列溶液。分别吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.6.2 稳定性试验。取同一供试样品溶液，按“1.2.5”色谱分析条件分别于1、2、4、6、8、12 h进样，进样量10 μL，测定峰面积积分值，计算RSD。

1.2.6.3 精密度试验。取按“1.2.3”方法制备的对照品溶液重复进样6次，计算峰面积的RSD值。

1.2.6.4 重复性试验。取样品按“1.2.4”方法制备供试品溶液6份，按“1.2.5”色谱分析条件，进样量为10 μL，测定峰面积，计算平均含量和RSD。

1.2.7 样品含量测定。按“1.2.4”方法精密称取白头翁汤药材粉末配制成供试品溶液各2份，按“1.2.6.1”方法对样品进行含量测定，通过标准曲线计算白头翁汤中各成分的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

在提取时间1 h、料液比1∶6的条件下，考察不同提取溶剂（纯水、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和100%乙醇）对浸膏得率的影响。结果发现（图1a），浸膏得率分别为16.28%、16.32%、16.77%、7.97%、6.43%，可见随着提取溶剂中乙醇含量的增加，浸膏得率不断降低。

在提取时间1 h、纯水作为提取溶剂条件下，考察不同料液比（1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10）对浸膏得率的影响。结果发现（图1b），浸膏得率分别为15.50%、13.52%、16.48%、16.74%和18.24%，可见随着料液比的不断增加，浸膏得率不断升高。

在纯水作为提取溶剂、料液比1∶6的条件下，考察不同提取时间（1、2、3、4和5 h）对浸膏得率的影响。结果发现（图1c），浸膏得率分别为17.26%、18.24%、18.37%、16.48%和 18.24%，可见随着提取时间的增加，浸膏得率基本趋于稳定。

2.2 正交试验 按照L 16（43）正交设计表条件进行试验，分别测得秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、秦皮素、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4含量以及得膏率，并进行多指标综合评分 [17]。评分时以各指标最大值为参照将数据进行归一化，根据原方中各药剂量再给出不同的权重。白头翁为一方之君，权重系数为0.4;黄连和黄柏中均有盐酸小檗碱，盐酸小檗碱含量表明了两味药的提取效果，权重系数设为0.2;黄柏碱为黄柏有效成分，权重系数0.1;秦皮素、秦皮甲素和秦皮乙素代表秦皮活性成分，其权重系数分别设为0.05、0.05和0.10;浸出物

代表提取效果，浸出物越多说明提取效率越高，因此设浸出物得膏率的权重系数为0.1。

综合评分：M=0.4a×100/4.63+0.2b×100/2.36+0.2c×100/3.53+0.05d×100/11.58+0.05e×100/2.31+ 0.1f×100/17.31+ 0.1q×100/17.84，式中，a为白头翁皂苷B4含量，b为盐酸小檗碱含量，c为黄柏碱含量，d为秦皮甲素含量，e为秦皮素含量，f为秦皮乙素含量，q为得膏率。以综合值进行统计分析，结果见表1。

皂苷B4、盐酸小檗碱、黄柏碱、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素的含量，并根据原方中各药用量进行加权计算。通过正交试验得出，提取溶剂对综合评分影响最为显著，料液比和提取时间影响较小，通过方差分析得出影响次序是提取溶剂>料液比>提取时间。综合考虑最佳工艺为A1B2C3，即以8倍60%乙醇为溶剂，提取3 h效果最佳。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察。按照“1.2.6.1”方法操作，以进样浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得线性回归方程、决定系数（R2）和线性范围如表2所示。

从表2可以看出，各标品在所选浓度范围内线性关系良好。所测定对照品保留时间分别为秦皮甲素4.36 min、盐酸小檗碱6.33 min、秦皮素11.20 min、黄柏碱11.68 min、秦皮乙素23.74 min、白头翁皂苷B4 27.04 min且分离度都大于1.5，分离良好。

2.3.2 稳定性试验。按照“1.2.6.2”方法操作，计算得出秦皮甲素、盐酸小檗碱、秦皮素、黄柏碱、秦皮乙素、白头翁皂苷B4峰面积积分值的RSD分别为0.29%、1.58%、0.63%、 0.10%、0.65%、0.10%，表明上述药材在12 h内比较稳定。

2.3.3 精密度试验。按照“1.2.6.3”方法操作，计算得出秦皮甲素、盐酸小檗碱、秦皮素、黄柏碱、秦皮乙素、白头翁皂苷B4峰面积的RSD分别为0.12%、0.77%、0.43%、0.20%、 0.66%、0.20%，表明在此试验条件下精密度良好。

2.3.4 重复性试验。按照“1.2.6.4”方法操作，计算得出秦皮甲素、盐酸小檗碱、秦皮素、黄柏堿、秦皮乙素、白头翁皂苷B4峰面积的RSD分别为6.54%、4.40%、5.92%、5.70%、 4.31%、8.75%，表明该方法重复性良好。

2.4 样品含量测定 取样品按“1.2.4”方法制备供试品溶液6份，根据“1.2.5”色谱条件每份测定3次，计算得出白头翁汤各成分秦皮甲素、秦皮乙素、盐酸小檗碱、秦皮素、黄柏碱、白头翁皂苷B4的含量分别为0.68%、0.31%、7.95%、0.49%、0.15%、4.15%。

3 结论与讨论

白头翁汤组方药物：白头翁、黄连、黄柏、秦皮，以上四药合用，共奏清热解毒、凉血止痢之功效，均有含量测定的指标性物质。在中药复方研究过程中，用一个指标不能全面概括其总体的效用。故此次试验选用白头翁皂苷B4含量、盐酸小檗碱含量、秦皮甲素含量、秦皮素含量、秦皮乙素含量、黄柏碱含量和得膏率为指标，概括了白头翁汤主要活性成分的指标，这与中药复方的多组分、多靶点的作用特点相吻合。该研究在处理试验数据时，使用了综合评分的方法，排除了以单一指标作为质量控制的局限性。以综合指标控制和评价中药制剂质量，是保证制剂和药效统一的更合理方法。采用RP-HPLC法测定含量，简便、快速、准确。

此次试验考察了提取溶剂、提取时间、料液比等汤剂提取的3个关键因素。 考虑指标间关系，结合了该方的君、臣、佐、使配伍和指标物质代表的药物等关系，给出不同的权重。综合分析得到最佳提取工艺组合为A1B2C3，即以8倍60%乙醇为溶剂，提取3 h效果最佳。该研究采用高效液相色谱法测定了白头翁汤有效成分的含量，试验结果表明，该含量测定方法简便、灵敏、重现性好，可推广使用。

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