鉴定动物奶源的多重RCR方法建立及应用

王天添 刘 悦 赵 远 王艳双 李明成，3 孙丽媛*

(1.北华大学 医学技术学院， 吉林 吉林132013；2.北华大学 医学院， 吉林 吉林 132013；3.吉林省中药DNA指纹检测技术科技创新中心，吉林 吉林132013)

据《中国统计年鉴2018》数据显示，我国奶制品产出量位居世界前五。作为高蛋白、高营养且易于被人体吸收的饮用品之一，奶产品深受大众欢迎。近年来，除牛奶外，羊奶、马奶、骆驼奶等特色奶也逐渐进入大众视野。受产出量[1]、稀有度以及营养价值不同的影响[2-8]，不同奶制品差价显著。不法商家借由对特色奶功效盲目吹捧，导致牛奶及各特色奶间价格差异不断增大[9-11]，并以低价奶、水、甚至伪乳蛋白掺假至高价奶中售卖，不仅侵犯消费者权益，也对国民身体健康造成严重威胁[12-13]。

针对动物奶源的研究多集中于相同奶制品中不同添加剂的检测及2种/3种奶源种属相近样品间检测[14-22]。未见成体系的牛奶与特色奶间的鉴别方法，无法一次性实现对各奶样的鉴别检测。多重PCR技术又称多重引物PCR或复合PCR技术，具有高效性、系统性及经济简便性等优点，可同时检测多种DNA，便于实行快速检测。本研究旨在建立一种多重PCR检测体系，对常见的5种液态奶(牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶和骆驼奶)进行鉴别，为我国奶制品市场监管提供便利。

1 材料与仪器

1.1 试验样品与试剂

牛奶、山羊奶、绵羊奶标准品奶样采自当地牧场，马奶、骆驼奶标准品奶样采自新疆南山牧场。24份混合奶样由标准品奶样等比例混合而成(具体可见2.4.4)。市售样品10份(牛奶5份，羊奶1份，山羊奶1份，马奶2份，骆驼奶1份)，购自当地超市以及线上销售处。

100 bp DNA Marker、50 bp DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix、组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；引物Bos-157、Cap-133、Ovi-80、Equ-188和Cam-113由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

TC9600-G多功能梯度PCR仪(美国Labnet公司)、JY300E通用型电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)、UV WHITE-2020D紫外凝胶成像分析仪 (美国Biorad公司)、NanoDropOne微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo公司)、YXQ-LS-75S11立式蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)、Thermo Fisher高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司)。

2 试验方法

2.1 奶制品 DNA提取

量取待测奶样约2 mL，分别置于干净Ep管中，7 000 r/min 离心3 min；弃去上层脂质层与中间层液体，400 μL PBS 溶液反复冲洗沉淀，7 000 r/min 离心3 min；弃去上层脂质层与中间层液体，加入400 μL体积比为酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的提取液，用移液枪反复吹吸，涡旋振荡至完全混合，12 000 r/min 离心5 min；弃去下层有机溶剂，加入400 μL 氯仿溶液，移液枪反复吹吸，振荡，12 000 r/min 离心5 min；弃去下层有机溶剂，余下步骤参照天根细胞基因组提取试剂盒说明书。

NanoDrop One微量核酸蛋白测定仪，1 μL上样测量。

2.2 设计特异性引物

GenBank中选取各动物线粒体基因序列为靶基因序列：牛(序列ID：KU291093.1)、山羊(序列ID：LT560065.1)、绵羊(序列ID：KU146454.1)、马(序列ID：LT560065.1)、骆驼(序列ID：KU146454.1)，NCBI Primer-Blast设计相应特异性引物(表1)。

表1 特异性引物序列Table 1 Sequences of specific primers

2.3 PCR反应

单重PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物 F和R(10 ng/μL)各0.5 μL，DNA 模板(10 ng/μL) 1 μL，无菌ddH2O补足至20 μL。反应参数：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

五重PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL；Bos-157(1.55 μmmol/L)、Cap-133(2.0 μmmol/L)、Ovi-80(10.0 μmmol/L)、Equ-188(10.0 μmmol/L)、Cam-113(10.0 μmmol/L)；每一物种DNA 模板(10 ng/μL)0.5 μL，共计2.5 μL；无菌ddH2O补足至30 μL。反应参数：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30 个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

PCR 产物检测：1.5%～2% 琼脂糖凝胶，100 V/cm 电泳60～100 min。紫外分析仪观察。

2.4 方法学评价

2.4.1引物特异性评价

以常见物种DNA(牛、山羊、绵羊、马、骆驼、驴、大豆和核桃)作为模板，分别以Bos-157、Cap-133、Ovi-80、Equ-188和Cam-113作为引物，按单重PCR反应体系、反应参数进行扩增，分析每对引物特异性。ddH2O作为阴性对照模板。1.5%琼脂糖凝胶，100 V/cm电泳60 min。紫外分析仪观察。

2.4.2多重PCR反应体系特异性评价

以1为递减数量依次减少体系中模板DNA物种数，按2.3中五重PCR反应体系、反应参数进行扩增，分析多重PCR反应体系特异性。ddH2O作为阴性对照模板。2% 琼脂糖凝胶，100 V/cm 电泳100 min。

2.4.3多重PCR反应体系灵敏性评价

提取标准品奶样DNA，ddH2O梯度稀释，终浓度为10～10-5ng/μL。参照2.3中五重PCR反应体系，保持其中4种模板浓度不变，改变剩余物种模板浓度，相同反应参数进行PCR扩增。根据电泳结果分析多重PCR反应体系灵敏度。

2.4.4混合奶样检测

取标准品奶样，均等混合制备混合奶样：4种奶源奶样混合(1∶1∶1∶1)、3种奶源奶样混合(1∶1∶1)、2种奶源奶样混合(1∶1)，共计24份混合奶样。参照2.1方法提取DNA,五重PCR反应体系进行扩增。2% 琼脂糖凝胶，100 V/cm 电泳100 min。紫外分析仪观察。

随机抽取其中5份混合奶样DNA，对本检测体系做重复性评价。

2.5 市售奶制品检测

按照2.1方法提取10份市售样品DNA，NanoDrop One微量核酸蛋白测定仪测定准确浓度，稀释至10 ng/μL。按照2.3中五重PCR反应体系扩增。2% 琼脂糖凝胶，100 V/cm 电泳100 min。

3 结果

3.1 奶制品 DNA提取

2.1方法提取奶样DNA，微量核酸蛋白测定仪测定，纯度均处于1.70～2.10，质量浓度均不低于100 ng/μL(表2)，证明本研究所建立奶制品DNA提取方法可有效提取奶样DNA，市售加工奶制品提取效率稍次于标准品，但皆可满足后续PCR要求。

表2 奶样DNA浓度及纯度检测Table 2 Concentration and purity of samples DNA

3.2 特异性检测

如图1(a)～(e)所示，各物种引物特异性试验中分别仅在牛、山羊、绵羊、马、骆驼处见单一特异条带，其他泳道皆无条带扩增，表明本研究所设计引物具有良好特异性。

如图1(f)所示，1～5号泳道依次见牛/山羊/绵羊/马/骆驼；牛/山羊/绵羊/马；牛/山羊/绵羊；牛/山羊；牛特异性条带。初步表明本研究所建立五重PCR反应体系特异性良好。

M,100 bp DNA Ladder；N,空白对照.(a)～(e): 1,牛；2,山羊；3,绵羊；4,马；5,骆驼；6,驴；7,大豆；8,核桃.(f): 1,牛/山羊/绵羊/马/骆驼；2,牛/山羊/绵羊/马；3,牛/山羊/绵羊；4,牛/山羊；5,牛M, 100 bp DNA Ladder; N, negative control. (a)-(e): 1, cow; 2, goat; 3, sheep; 4, horse; 5, camel; 6, donkey; 7, soybean; 8, walnut. (f): 1, cow/goat/sheep/horse/camel/donkey; 2, cow/goat/sheep/horse/camel; 3, cow/goat/sheep; 4, cow/goat; 5, cow图1 引物特异性检测Fig.1 Specific tests of primers

3.3 灵敏性检测

如图2(a)～(e)所示,调节5种动物奶源模板DNA浓度，使其中任一模板浓度梯度递减，其余4种模板浓度保持不变。最佳多重PCR反应条件进行扩增检测，牛、山羊、绵羊、马、骆驼最低检测限均可达到1 ng/μL，其他4种特异条带亮度不受影响。表明本研究所建立多重PCR检测体系结果稳定，当任意一种DNA减少至1 ng/μL时，仍可准确检测，且无交叉干扰。

M, 100 bp DNA Ladder； 1, 10 ng/μl； 2, 1 ng/μl； 3, 10-1 ng/μl； 4, 10-2 ng/μl； 5, 10-3ng/μl； 6, 10-4ng/μl； 7, 10-5 ng/μl； N, 空白对照Note: M, 100 bp DNA Ladder; 1, 10 ng/μl; 2, 1 ng/μl; 3, 10-1 ng/μl; 4, 10-2 ng/μl; 5, 10-3 ng/μl; 6, 10-4 ng/μl; 7, 10-5ng/μl; N, Negative control图2 多重PCR检测体系灵敏性检测Fig.2 Sensitivity test of multiplex PCR detection system

3.4 混合奶样检测

人工模拟均等混合奶样检测，5种标准品奶样均等混合检测结果作为阳性对照，显示5条特异性条带；无模板检测结果为阴性对照，对应泳道无条带。图3为10份2种奶样均等混合、10份3种奶样均等混合和4份4种奶样均等混合检测结果，各泳道仅出现特异性条带，所有条带清晰明亮。试验结果表明本五重PCR检测体系可基本满足动物奶源实际掺假情况检测。

M,50 bp DNA Ladder；P,阳性对照；N,空白对照.(a): 1,牛/山羊；2,牛/绵羊；3,牛/马；4,牛/骆驼；5,山羊/绵羊；6,山羊/马；7,山羊/骆驼；8,绵羊/马；9,绵羊/骆驼；10,马/骆驼；11,牛/山羊/绵羊；12,牛/山羊/马 (b): 1,牛/山羊/骆驼；2,牛/绵羊/马；3,牛/绵羊/骆驼；4,牛/马/骆驼；5,山羊 -绵羊/马；6,山羊/绵羊/骆驼；7,山羊/马/骆驼；8,绵羊/马/骆驼；9,牛/山羊/绵羊/马；10,牛/山羊/绵羊/骆驼；11,山羊/绵羊/马/骆驼；12,牛/绵羊/马/骆驼M, 50 bp DNA Ladder; P, Positive control; N, Negative control. (a): 1, cow/goat; 2, cow/sheep; 3, cow/horse; 4, cow/camel; 5, goat/sheep; 6, goat/horse; 7, goat/camel; 8, sheep/horse; 9, sheep/camel; 10, horse/camel; 11, cow/goat/sheep; 12, cow/goat/horse (b): 1,cow/goat/camel; 2, cow/sheep/horse; 3, cow/sheep/camel; 4, cow/horse/camel; 5, goat/sheep/horse; 6, goat/sheep/camel; 7, goat/horse/camel; 8, sheep/horse- camel; 9, cow/goat/sheep/horse; 10, cow/goat/sheep/camel; 11, goat/sheep/horse/camel; 12, cow/sheep/horse/camel图3 混合奶样检测Fig.3 Detection of mixed milk samples

3.5 市售样本检测

10份奶样中，5份牛奶试样仅检测出牛源性特异性目的条带，2份羊奶试样中除了检出羊源性条带，皆检出牛源性条带，说明有牛奶掺入，2份马奶、1份骆驼奶中均只检出相应的马与骆驼源性成分，未见掺假其他动物源性成分的情况(图4)。

M,50 bp DNA Ladder；P,阳性对照；1,牛奶；2,牛奶；3,牛奶；4,牛奶；5,牛奶；6,羊奶；7,山羊奶；8,马奶；9,马奶；10,骆驼奶；N,空白对照M, 50 bp DNA Ladder; P, positive control; 1, milk; 2, milk; 3, milk; 4, milk; 5, milk; 6, goat milk; 7, goat milk; 8, horse milk; 9, horse milk; 10, camel milk; N, negative control图4 市售样品检测Fig.4 Testing of commercially available samples

4 讨 论

中国奶文化传承数千年，奶产品在日新月异的今天俨然已经成为广大民众的生活必需品。不同动物奶的产出率、营养价值及受欢迎程度等差异使奶产品间差价愈发显著。骆驼奶、马奶等高价奶受不完善产业链的影响，产出率较牛奶低。不法商家为谋求利益，扰乱奶制品市场，恣意出售掺假高价奶，严重侵犯消费者权益。良好的产品质量监管既是中国奶业快速发展的必需条件，也是保障消费者权益的重要前提。目前，奶产品掺假鉴定方法主要通过不同奶制品营养成分的差异(蛋白质、脂肪、DNA分子和β-胡萝卜素等)作为切入口，对奶产品做质量分析[15-19]。

尹艳[19]应用SDS-PK法区分骆驼奶与豆浆，PCR方法对牛奶、羊奶、水牛奶、骆驼奶和豆奶进行鉴别，酶切鉴别牛奶、水牛奶与耗牛奶，并进一步建立荧光定量PCR方法对牛奶进行定量分析。虽然可以对牛奶及常见奶制品进行简单鉴别，但检测一种样品需多次PCR验证，试剂耗损严重，检测时间长，不适合广泛应用于市场上奶制品监管检测。杜文博[20]根据挥发物质的不同应用气相色谱-离子迁移谱对牛奶粉、羊奶粉及掺假羊奶粉进行鉴别，但此方法并不适用于多种液态奶间鉴别。陈筱婷[21]针对牛奶、羊奶、豆奶建立了三重荧光PCR检测体系，实现了牛、羊奶间掺假鉴别。范阳阳等[22]通过多重PCR检测体系检测羊奶中牛、大豆源性成分。未见牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶及骆驼奶间完好鉴定体系。

本研究基于多重PCR技术，建立针对牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶及骆驼奶的多重PCR检测体系，动物奶源DNA含量低至检测样品总DNA含量2.4%时，仍可准确检测。检测灵敏度高，重复性好，充分保证检测准确性；无需大型精密检测仪器，耗费较少；应用最常见的琼脂糖凝胶电泳即可对结果进行分析。一次检测即可鉴定常见奶源DNA掺假情况，良好特异性引物的选择，避免了假阳性的出现，在条件允许时，可进一步对样品PCR产物进行测序分析，对检测结果做进一步验证。高准确性、低成本的特点为市场奶产品掺假检测提供便利基础，适用于奶类市场质控监测。未来可考虑将本研究成果与侧向流技术联用，将检测体系试纸条化，实现现场即时检测；也可通过荧光定量PCR技术，建立多重荧光定量检测体系，进一步分析待测样品中动物奶源DNA含量。