基于网络药理学与分子对接探讨木瓜治疗膝骨关节炎的分子机制△

时孝晴，梅伟，茆军，张农山，邢润麟，殷松江，王培民

南京中医药大学附属医院/江苏省中医院，江苏 南京 210029

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种中老年常见、多发疾病。伴随全球人口老龄化的不断发展，KOA的发病率逐年递增，逐渐成为全球范围内的公共健康挑战[1]。多数KOA患者临床表现为关节酸痛不适，当疾病进一步进展时，患者膝部常疼痛难忍，严重影响其生活质量，甚至最终导致残疾。木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果实，性味酸、温，归肝、脾二经，主要用于湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、吐泻转筋、脚气水肿等。《日用本草》记载：“木瓜治脚气上攻，腿膝疼痛，止渴消肿”。《食疗本草》亦记载：“煮木瓜令烂，研作浆粥样，用裹痛处，冷即易，一宿三、五度，热裹便差。煮木瓜时，入一半酒同煮之，治脚膝筋急痛”。《本事方》中记载：“木瓜煎可治筋急项强，不可转侧”。在临床运用木瓜时，虽不将木瓜作君药使用，但以木瓜为臣、为佐，常起到良效。正如《本草新编》曰：“木瓜，但可臣、佐、使，而不可以为君，乃入肝益筋之品，养血卫脚之味，最宜与参、术同施，归、熟(地)并用”。木瓜治疗KOA疗效确切，但其具体作用机制尚不清楚。

随着现代药理学、计算机学、分子生物学、生物信息学的迅速发展，网络药理学逐渐成为一种新型疾病-药物预测模式[2]。其在“药物-靶点-疾病”的理论框架下，深度挖掘药物数据库、疾病数据库、基因数据库等，并以网络图的形式进行展示，借以阐释复杂的药物如何作用于人体。中药具有多成分、多靶点、多通道的复杂特点，这一特征与网络药理学的整体性、系统性相一致。近年来，通过网络药理学研究中药的作用机制取得了巨大进步，成为探索中医药治疗疾病具体靶点与通路的有力工具。故本研究借助网络药理学，探索木瓜的靶点、通路以及药物有效成分之间的互作关系，为其治疗KOA提供机制理论支撑。

1 资料与方法

1.1 化合物成分收集与筛选

在中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中检索木瓜的中药化学成分信息，其筛选条件设置为药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，获取药物活性成分[3-4]。

1.2 木瓜及KOA相关作用靶点获取

以“knee osteoarthritis”作为关键词，通过GeneCards(https：//www.genecards.org/)与OMIM(https：//www.omim.org/)数据库，检索并筛选与KOA相关的作用基因。通过UniProt数据库(https：//www. uniprot.org/uniprot/)将2.1项中所获得的药物作用靶标转化为与GeneCard数据库相匹配的基因名称(gene name)。最后，将木瓜活性成分的靶点预测结果和KOA相关靶标的检索结果进行匹配，并选择重叠靶点作为木瓜治疗KOA的核心靶点。利用Venny 2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具进行木瓜活性成分靶点和KOA靶点的映射并绘制韦恩图。

1.3 药物活性成分与疾病作用靶点网络构建

将木瓜的活性成分和KOA相关靶点筛选结果导入Cytoscape Version 3.7.1软件[5]，构建木瓜活性成分与KOA靶点网络。其网络的节点(node)表示靶点或活性成分，边(edge)表示其相互作用。Cytoscape软件的核心架构是网络，每个节点是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的连接代表这些生物分子之间的相互作用。节点的度值(degree)代表网络中节点与节点相连的数目，度值越大，这个靶点越有可能成为化合物的关键作用靶点。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络构建与核心基因筛选

String数据库(https：//string-db.org/)收集了大量蛋白相互作用关系，并给出了数据置信范围(低置信度：<0.4；中等置信度：0.4～0.7；高等置信度：>0.7)。在此基础上，将木瓜的蛋白靶点导入STRING数据库，物种限定Homo sapiens，置信度为0.7，进行PPI网络分析，绘制PPI网络图。将该图导入Cytoscape version 3.7.1软件进行拓扑属性分析。借助“Network analyzer”功能，计算参与互作靶蛋白的度值和介数(betweenness)。PPI网络连线的粗细代表互相作用的强弱，靶点的度值反映了1个节点与其他节点的连接数目，度值越大代表此节点与其他节点的关系更紧密，在网络中地位越重要。对度值按降序进行排序，筛选出序号前20的靶点为关键靶点，借助R project软件绘制条形图，显示基因名与其连接节点数目。

1.5 GO与KEGG富集分析

使用半编程性质的脚本性软件R project，可实现多种生物信息分析与结果可视化。先利用RGUI及org.Hs.eg.db获取核心靶点的entrezID，然后利用RGUI、DOSE及ClusterProfiler对核心靶点进行GO功能富集(molecular function，MF；biological process，BP；cellular component，CC)及KEGG通路进行富集。在程序语言中，将Pvalue Cutoff=0.05，Qvalue Cutoff=0.05，分析结果选择富集程度最高的前20条，选择气泡图的形式予以展示。最后利用R project软件及pathview，通过KEGG数据库(KEGG，https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)下载富集排名前20名通路。通过人工查阅相关文献及反复对比筛选后，最终纳入结果。

1.6 分子对接

Discovery Studio 2016 3.0是一个新一代分子建模和模拟环境，应用于蛋白质结构功能研究以及药物发现。采用Discovery Studio 2016 3.0对蛋白相互作用网络中度值靠前的3个靶点与木瓜药效成分进行分子对接验证。保存分子对接结果，并对其LibDock score进行分析，用以评价木瓜活性成分与靶点之间的结合活性。并用临床上广泛应用于治疗KOA的阳性药物塞来昔布(celecoxib)进行对照分析。

1.6.1活性成分与KOA作用靶点晶体的获取 通过活性成分与疾病作用靶点网络构建，得到木瓜的类药成分与KOA作用靶标。上述类药成分、塞来昔布(阳性对照药物)的mol2结构和KOA相关靶点的蛋白质晶体结构，分别通过Chemical Book数据库(https：//www.chemicalbook.com/)、RCSB PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)下载。

1.6.2对接步骤及结果评价 将1.6.1得到的结果依次导入Discovery Studio 2016 3.0软件，进行预处理。首先对每个类药成分进行Prepare Ligands，参数为默认值，保存为分子对接配体。其次通过Prepare Protein，参数取默认值，得到预处理蛋白质结构，抽离靶点原配体，保存为分子对接受体。受体活性位点选择原配体抽离位置，在LibDock模块设定Docking Preferences为High Quality，对接匹配方法(Conformation Method)为BEST，Parallel Processing为True，其他参数取默认值。对接结果以打分函数LibDock score给出，LibDock score越高，预测成分与靶点结合的活性越高。

2 结果

2.1 木瓜活性成分的筛选

检索TCMSP数据库，筛选条件为OB≥30%、DL≥0.18，共检索到木瓜中包含4个活性成分，对4个活性成分进行手工检索相关靶点，最终纳入3个有效活性成分,包括槲皮素、白桦脂酸、表儿茶酸，见表1。

表1 TCMSP中木瓜的活性成分

2.2 木瓜活性成分靶点库与KOA作用靶点集的构建

检索TCMSP数据库中成分靶点，其收录的木瓜中成分作用靶点共162个。使用Uniprot数据库收集作用靶点的基因名(gene name)，删除无效与重复的靶点，最后得到78个活性成分作用靶标。通过GeneCards、OMIM数据库检索整合得到1543个KOA相关基因靶点。将78个活性药物靶点与1543个KOA相关靶点基因进行映射，得到44个共同靶点基因，韦恩图见图1，具体药物活性成分靶标见表2。

图1 KOA靶点与木瓜成分靶点韦恩图

表2 木瓜治疗KOA潜在靶标信息

2.3 构建“药物-成分-疾病-靶点”网络

将3种药物活性成分和44个疾病相关作用靶点筛选结果进行映射，去除无对应靶点的化学成分，并删除重复的靶点。将数据导入Cytoscape 3.7.1软件，构建药物靶点-疾病靶点交集网络，见图2。由图2可得，此网络共包括节点50个，边93个。木瓜的1种活性成分可对应1个或多个疾病靶标，多种药物活性成分可对应相同的疾病靶标，提示木瓜治疗KOA具有多成分、多靶标的特点。

注：绿色椭圆形代表中药名称；紫色八边型代表疾病名称；青色三角形代表药物有效成分；蓝色四边形代表疾病作用靶标。图2 中药化合物-靶点网络

2.4 PPI网络分析

将木瓜可能治疗KOA的44个关键靶标导入STRING数据库，获取其相互作用关系并保存PPI网络图与TSV格式文件，见图3。PPI网络中共包含节点44个，边122条。充分体现了中药治疗疾病作用机制的复杂性。在PPI网络中，度值较高即处于较为核心位置的靶点包括VEGFA、IL6、ESR1、CASP3等。利用R软件绘制条形图，展示了PPI网络中度值中心性较高的前20位的靶点，见图4。

图3 木瓜治疗KOA潜在作用靶点间的PPI网络

图4 PPI网络中排名前20的关键靶点

2.5 GO和KEGG通路富集分析

分析44个核心靶点主要富集的分子功能、生物过程、细胞成分。结果显示，木瓜治疗KOA的核心靶点共在65个GO term上富集。其中所涉及的生物学功能与过程主要包括RNA聚合酶II转录调节区序列特异性DNA结合转录因子活性参与转录的正调节、蛋白质异二聚化活性、RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性DNA结合、核心启动子近端区序列特异性DNA结合、染色质结合、配体激活的序列特异性DNA结合RNA聚合酶II转录因子活性等，与细胞增殖、细胞凋亡及调控细胞代谢等生物学过程密切相关。以P<0.05为阈值筛选排名前20的GO分析结果，见图5。对木瓜治疗KOA的44个核心靶点进行KEGG富集分析，分析结果显示，共富集在83条通路上，其中与KOA通路相关的主要包括细胞凋亡、PI3K-Akt、肿瘤坏死因子(TNF)、核转录因子-κB(NF-κB)以及p53信号通路等。这些经典信号通路对KOA的发生、发展起到重要作用。以P<0.05为阈值筛选排名前20的KEGG分析结果，见图6。GO和KEGG分析提示木瓜可以通过以上多条通路作用于KOA。

图5 木瓜活性成分潜在治疗KOA靶点的GO功能分析

图6 木瓜活性成分潜在治疗KOA靶点的KEGG富集分析

2.6 靶点通路分析

利用KEGG Mapper工具获取木瓜治疗KOA的通路图(见图7)。木瓜与KOA相关靶点标记为红色。细胞凋亡通路图显示，木瓜治疗KOA涉及12个效应靶点。

2.7 分子对接分析

Discovery Studio分子对接验证网络药理学。LibDock score代表分子对接吻合度，分数越高代表配体与受体蛋白结合性越好。分子对接结果表明，木瓜活性成分与KOA部分关键靶点蛋白分子对接吻合度较好。木瓜活性成分与塞来昔布相比，分子对接吻合度无明显差异。与此同时，也间接验证了木瓜对于KOA的VEGFA、IL6、ESR1等靶点具有调节作用。分子对接结果与网络药理学筛选结果一致，用分子对接的方式验证了网络药理学的可靠性。木瓜成分配体与KOA靶蛋白受体的对接结果见表3，对接过程见图8。

注：红色表示木瓜治疗KOA靶点。图7 木瓜在细胞凋亡通路中的作用靶点

表3 配体受体蛋白分子对接的结果

注：A.IL6与塞来昔布对接过程；B.IL6与表儿茶酸对接过程；C.VEGFA与表儿茶酸对接过程；D.VEGFA与塞来昔布对接过程；E.ESR1与槲皮素对接过程；F.ESR1与塞来昔布对接过程。图8 木瓜活性成分、塞来昔布和KOA相关靶点的部分对接过程

3 讨论

KOA是一种慢性关节退变性疾病，其主要表现在于关节软骨退化、关节边缘和软骨下骨的反应性增生[6]。流行病学调查发现，60岁以上人群当中，全球KOA患病率达10%以上，而中国农村人群中其患病率超过16%，给患者、家庭及社会带来了较为沉重的经济压力[7]。现在临床常用于治疗KOA的药物，如非甾体抗炎药(NSAID)，存在消化系统、心血管系统等不良反应。与此同时，葡萄糖胺和软骨素等软骨保护剂与安慰剂组相比，亦没有显著的临床益处[8]。中医中药的简、便、廉、效及其较小的不良反应等优势逐渐凸显。

祖国传统医学认为KOA属于“痹症”范畴。木瓜具有舒筋活络、和胃化湿的功效，可用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛。木瓜治疗KOA疗效显著，但更为确切的治疗靶点、通路不清，缺乏相关分子层面的研究。KOA-木瓜靶点基因网络揭示，引起KOA的靶点众多，且靶点之间存在着复杂的作用关系，并非单一靶点起作用。中药治疗KOA具有多成分、多靶点的特点，采用网络药理学分析有利于从分子水平阐明其作用机制。

通过检索数据库并设置筛选条件，最终得到3个有效活性成分，包括槲皮素、白桦脂酸与表儿茶酸。现代研究发现，槲皮素具有抑制膝关节中软骨细胞凋亡、减弱氧化应激反应、抑制软骨细胞外基质降解的作用[9-12]。表儿茶酸对成骨细胞具有双向调节作用，在中低浓度时可促进成骨细胞增殖，高浓度时对其产生抑制作用[13]。白桦脂酸呈剂量依赖性的抑制了白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3、MMP-13、前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮(NO)生成，其可能是通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)来抑制IL-1β诱导的KOA[14]。

此项研究通过木瓜靶点与KOA靶点构建网络，基于节点的度值，对包括VEGFA、IL6、ESR1、CASP3、CCND1等排名前20的关键靶点进行了排序。KEGG通路富集与靶点通路分析显示，KOA发生机制与相关靶点及其所分布的通路有密切关联。这与目前对上述中药活性成分及其关键靶点的研究结果和其与KOA间关系的相关研究基本一致。

VEGFA是血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员，其表达水平降低可以增强软骨形成和预防骨关节炎的疾病进展[15]。其原因可能由apelin介导的滑膜VEGF参与了KOA的疼痛通路[16]。同时研究表明，抑制VEGF不仅可以增强软骨细胞分化，还可以保护软骨细胞免受TNF-α诱导的软骨细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化[17]。IL-6是一种强烈激活免疫系统并增强炎症反应的细胞因子，其参与各种炎性疾病的发病过程。对IL-6进行抑制，一方面减少了碘乙酸单钠诱导的骨关节炎(OA)大鼠实验模型的疼痛行为，另一方面，通过阻断IL-6或信号传导及转录激活蛋白-3(STAT-3)，可以减轻内侧半月板失稳造成的OA大鼠的疼痛症状[18]。ESR1属于配体调控转录因子的核受体(NR)超家族，可表达于成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞以及骨细胞，软骨细胞中E2靶向活化ESR1，通过抑制ERK磷酸化激活，进而抑制ERK信号通路，促进自噬流的形成，激活自噬，减少凋亡，进而引起软骨细胞的增殖[19-20]。Meta分析及基因相关性研究同样显示，ESR1基因与KOA具有相关性[21-22]。CASP3是细胞凋亡过程中的关键酶。Takada等[23]发现,OA的病理进展与细胞凋亡与内质网应激反应有关，CASP3活化与软骨退变、软骨细胞凋亡具有相关性。在KOA人群中CCND1的表达下调，且随着KOA严重程度的增加，其下调越多。当CCND1过表达时，其可以逆转FOXD2-AS1抑制对软骨细胞活力的影响[24-25]。

根据GO注释结果可知，木瓜主要通过影响关节软骨代谢、生长和修复，细胞增殖、分化、凋亡和抵抗氧化应激、炎症等通路而发挥治疗KOA的作用。通过KEGG富集分析，其结果主要富集在细胞凋亡、TNF、NF-κB、p53、AGE-RAGE等信号通路。

细胞凋亡是细胞的一种程序化死亡。现代研究发现，调控KOA软骨细胞凋亡的信号通路复杂多样，如PI3k/Akt信号通路、MAPK信号通路、MAPK/JNK信号通路、MAPK/ERK1/2信号通路、TLR4信号通路等[26-28]。p53是一种转录调节因子，在细胞凋亡的启动中发挥重要作用，当发生物理损伤、缺氧、代谢异常时可引起p53的过度表达，过度表达的p53能够刺激Bax基因表达增加，使Bax和Bcl-2的比例失调，从而促进细胞凋亡[29]。在凋亡信号转导的级联反应中，过度表达的p53作用于线粒体，使其膜电位以及通透性改变，释放细胞色素C，从而激活Caspase-3，亦引起细胞凋亡的发生[30]。TNF-α是促炎细胞因子的一种，其在炎症过程中发挥重要作用[31]。TNF-α诱导产生MMP，包括MMP-1、MMP-3、MMP-13及ADAMTS-5等[32]。同时TNF-α能够激活NF-κB信号通路，使得TNF-α的促炎功能进一步加强[33]。Özler等[34]发现，在晚期KOA患者的血清与膝关节滑液中的TNF-α升高与疾病等级呈正相关。随着疾病严重程度的进展，滑液MMP-13和血清TNF-α水平明显增加，但TNF-α水平是一种全身性升高，MMP-13水平则在局部升高。在关节炎组织中，NF-κB信号传导途径可以被促炎细胞因子、机械应激和细胞外基质降解产物激活，这种活化可以调节许多细胞因子、炎症介质、转录因子和几种基质降解酶的表达[35]。在KOA的病理进展中，其被KOA软骨细胞活化。NF-κB信号通路不仅与促炎、应激等相关，而且该通路的激活可促进软骨细胞分化为肥大样状态[36]。持续的NF-κB活化可诱导ELF3、HIF2、RUNX2等转录因子，进而引发MMP-13和ADAMTS5蛋白酶的产生，其促进关节软骨细胞从前肥大状态转变为终末分化肥大状态[36]。

综上所述，本研究采用网络药理学方法和技术，筛选出木瓜中3种药物活性成分和81个潜在治疗靶点。共有1543个KOA疾病相关靶标，其中44个是木瓜-KOA的共同靶标。通过对GO生物过程和KEGG信号通路的富集分析，初步预测木瓜可能通过槲皮素、白桦脂酸、表儿茶酸等有效活性成分调控VEGFA、IL6、ESR1、CASP3、CCND1等靶点，调节细胞凋亡、TNF、p53、NF-κB、AGE-RAGE等信号通路，最终抑制炎症反应，调节免疫功能，干预细胞凋亡过程，从而治疗KOA。网络药理学的分析结果一方面说明了引起KOA因素多且复杂，另一方面也直观的表明了木瓜多成分、多途径、多靶点治疗KOA的特点，研究结果有助于对KOA发病机制的理解，并在预防和治疗KOA方面拓展了新的治疗策略。但由于数据库、相应的分析算法和各种平台的软件功能的局限性，其结果可作为开展实验研究的线索，但具体机制有待实验研究进一步验证。