二维薄层色谱法在苦参生物碱成分分析中的应用*

张潇晗，郑秋涵，支雅静，杨梦婷，牛丽颖,2,3，毕晓东,2,3

(1 河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200；2 河北省中药配方颗粒技术创新中心，

薄层色谱法由于设备和操作十分简便，被广泛用于中药等复杂样品的初步分离和定性分析中。通常样品点在展开剂的作用下在平面固定相上沿着一个固定方向展开(即一维薄层)，在展开剂和固定相之间的分配作用等相互作用下，分离成几个样品点[1-3]。二维薄层色谱法是在传统的一维薄层色谱法的基础上，通过引入具有正交性的固定相或者展开剂，在一维分离方向的正交方向上进行第二次的展开(及二维展开)，可以弥补一维方向上分离不充分的缺点，同时提供一维和二维上的比移值(Rf)进行双重定性。相比与在一维方向上进行二次展开，二维展开的展开剂体系的选取更加灵活多样[4-5]。

苦参苦，寒。归心、肝、胃、大肠、膀胱经，具有清热燥湿，杀虫，利尿等功效，苦参中含有多种化学成分，主要以生物碱(苦参碱及氧化苦参碱)为主，其次为黄酮[6-7]。本研究以苦参中的生物碱为分析对象，建立二维薄层色谱分析的方法，提供多维度的分离信息，并采用离线的液质联用技术综合评价二维薄层的定性分离能力。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

滴管、尺子、铅笔、硅胶板切割刀、薄层色谱硅胶预制板(型号HSG，规格200×100，质量标准鲁Q/YT257-58，涂层厚度0.01～0.05 mm，硅胶粉粒度HPTLC8±2 μm≥80%，TLC 10～40 μm，散射参数：SX=3)、TLC板式加热器、展开缸、点样管、喷瓶、微型离心仪、吹风机、家用微波炉、AB SCIEX液质联用仪器。

苦参碱、氧化苦参碱、苦参对照药材购置于中检所，氯仿、甲醇、乙腈、纯净水、氨水、冰醋酸、碘化铋钾(分子式BiI3·4KI，分子量1253.70，含Bi量不少于16.0%，含碘量不少于69%)均为试剂纯，显色剂：碘化铋钾0.85 g+10 mL冰醋酸+40 mL水。

1.2 实验方法

二维薄层色谱方法，包括切板、点样、一维展开、二维展开和显色，具体如下。

1.2.1 切 板

用硅胶板切割刀将薄层板切成长宽相近的矩形，划线(如图1所示，两线交叉处为点样处，标有1D的为一维展开方向，标有2D为二维展开方向，一维与二维的展开方向互相垂直)，待用。

图1 二维薄层色谱板的划线示意图

1.2.2 点 样

取用一根干净的点样管吸取待测样品点约10 μL于二维薄层板的点样处，控制点样大小，每次点样后用吹风机烘干，反复多次直至点完所吸样品溶液。

1.2.3 一维展开

取用一个干净干燥的展开缸，向展开缸内加入一维展开剂，盖盖，使其密闭达到饱和状态，5 min后将点好样的硅胶板放入其中按照一维展开方向展开，使硅胶板的底端划线处浸入一维展开剂中，盖盖，待硅胶板上的液体上升至距硅胶板顶端1 cm左右的位置，将其取出，置于TCL板式加热器烘干。

1.2.4 二维展开

取用一个干净干燥的展开缸，向展开缸内加入二维展开剂，盖盖，使其密闭达到饱和状态，5 min后将硅胶板放入其中按照二维展开方向展开，使硅胶板的底端划线处浸入二维展开剂中，盖盖，待硅胶板上的液体上升至距硅胶板顶端1 cm左右的位置，将其取出，置于TCL板式加热器烘干。

1.2.5 显 色

均匀喷洒显色剂于硅胶板上，观察实验现象。

1.2.6 液质联用测试条件

液相条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；以乙腈-0.1%乙酸(3:97)为流动相，流速：0.3 mL/min，进样量：1 μL。

质谱条件：气帘气：35 psi；喷雾电压：5500 V；温度：550 ℃；气路1:40 psi；气路2:40 psi。采用MRM进行测试，苦参碱离子对：249.2/148.0，氧化苦参碱离子对：265.1/148.0。

1.2.7 液质分析样品制备

将苦参提取液的二维展开板(未显色)的目标区刮下，加入2 mL的90%乙醇溶液，再加入5 μL的冰醋酸，超声2 min，离心，取上层清液，用0.22 μm滤膜过滤后，进行液质分析。将苦参提取液用0.22 μm滤膜过滤后，进行液质分析。

2 结果与讨论

2.1 二维展开剂系统的筛选

选取不同的展开剂组合成二维展开体系进行实验(所选展开剂见表1)，考察一维和二维展开情况，当一维展开剂使用氯仿:甲醇= 4:1，二维展开剂使用乙腈:水=9:1(氨水饱和)时，苦参提取液在一维和二维均能够展开。采用筛选出来的二维展开体系，测试苦参提取物、苦参碱和氧化苦参碱的标准品供试液，对比二维展开结果。

实验所用薄层色谱板的材料为硅胶，表面具有硅羟基，是极性较强的分离介质，通常可以用于正相色谱分析，也可以用作亲水相互作用色谱分析。因此一维展开采用分析生物碱的常用展开剂可以分离出生物碱，而二维展开剂采用高比例的乙腈，在亲水相互作用模式下可以对一维粗分离得到的斑点进行进一步分离。

2.2 二维薄层色谱分析结果

采用筛选出来的二维展开剂体系，测定苦参提取液、苦参碱和氧化苦参碱标准品。见图2～图4。各二维薄层的比移值见表2。经过Rf值的初步对比分析，苦参提取液在二维展开后得到的斑点1为氧化苦参碱，斑点2未知，未见苦参碱的斑点。

图2 苦参提取物的二维薄层色谱图

二维薄层色谱可以在第二维对第一维无法分离的斑点提供进一步分离，相比二次展开，展开剂选择更为广泛，不必考虑对其他斑点的影响。此外，二维薄层色谱为每一个斑点提供2个Rf值作为定性比对的基础，采用双Rf值对比，可以提供更准确的定性分析结果。

图3 苦参碱标准品的二维薄层色谱图

图4 氧化苦参碱标准品的二维薄层色谱图

表2 二维薄层色谱的Rf值

2.3 液质联用分析

将苦参提取液的二维展开板(未显色)的斑点1和斑点2的区域(以下称氧化苦参碱区)，以及苦参碱标准品的对应区域(以下称苦参碱区)刮下(刮板情况见图5)，按照2.4.2项下方法进行提取处理，然后进行液质分析。

图5 苦参提取液的二维薄层刮板情况

苦参提取液、二维展开后的苦参碱区、氧化苦参碱区的液质分析结果见图6～图7。苦参提取液中含有苦参碱和氧化苦参碱。苦参碱区虽然没有观察到生物碱的显色斑点，但仍有苦参碱的离子对信号。氧化苦参碱区除了氧化苦参碱的离子对之外，还存在苦参碱的离子对信号，由于该区域并不是苦参碱的二维展开区，因此该信号(即斑点2)可能为苦参碱的同分异构体，可能为槐定碱。

图7 苦参碱的液质图

图6 苦参提取液的液质图

由于液质联用的检测限远远高于薄层显色，因此二维薄层的不同区在液质联用中的纯度并不高，主要原因是薄层显色仅为浓度高的区域，而硅胶底部的低浓度区无法显色，但仍然能够被质谱检测到，其他原因还可能是苦参提取液的浓度不够高、斑点2为苦参碱的同分异构体。

图8 氧化苦参碱的液质图

3 结 论

本研究充分利用薄层色谱硅胶板的性质，建立的二维薄层色谱分析方法，并用于苦参提取物的分析，二维薄层色谱可以在第二维对第一维无法分离的斑点提供进一步分离，并且能够每一个斑点提供2个Rf值作为定性比对的基础。采用液质联用技术对薄层展开斑点区进行进一步验证，对二维薄层色谱方法的优缺点的客观评价提供了强有力的证据。