早期断奶及谷氨酰胺添加对仔猪血清游离氨基酸及其代谢产物的影响

2020-11-14赵广民刘秀婷吕文涛王远霞肖英平

浙江农业学报 2020年10期

赵广民，刘秀婷，代兵，杨华，吕文涛，王远霞，肖英平，*

(1.省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州 310021； 2.浙江农林大学动物科学学院，浙江杭州 311300)

仔猪早期断奶是集约化养猪生产的一项新技术，可以有效控制传染病传播，通过缩短母猪哺乳期而达到提高繁殖率的目的。但过早断奶易导致仔猪采食量减少、生长受阻、消化不良等一系列不良反应[1]，还会影响猪肠道屏障功能相关基因表达[2]。有研究统计，我国采用早期断奶技术能节省近600亿元资金，断奶仔猪免疫系统一般在4～7周时才能发育成熟[3]。在2020年我国全面禁抗形势下，寻求可替代产品迫在眉睫。

氨基酸模式是蛋白质中各种必需氨基酸的构成比例，蕴含着反映机体代谢和功能状态的重要生物化学信息[4]。谷氨酰胺是最丰富的游离氨基酸和蛋白结合氨基酸[5]，是组织间氮运输载体、核苷酸和其他氨基酸合成前体，以及快速分化细胞的主要能源物质[6]。饲料中添加0.20% L-谷氨酰胺对猪生产性能和健康的影响与抗生素类似[7]。本试验以21日龄断奶仔猪为研究对象，旨在研究早期断奶及谷氨酰胺添加对仔猪血清中游离氨基酸及其代谢产物含量的影响，从而寻求缓解仔猪断奶应激和营养应激方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择8头相同胎次的经产母猪，每头母猪生产的仔猪中选择体质量相近的“杜×长×大”仔猪各3头。L-8900离子交换氨基酸分析仪，日本日立集团。

1.2 试验设计和饲养管理

在“杜×长×大”仔猪(Duroc×Landrace×Large Yorkshire strain)21日龄时，从每头母猪生产的仔猪中选取3头体质量相近的小母猪用于试验，共计24头。将小母猪随机分成3组，每组4个重复，每个重复2头猪。哺乳组(suckling group，S)仔猪继续留在母猪身边自由摄取乳汁；断奶组(weaned group，W)进行断奶处理并饲喂基础饲粮；谷氨酰胺组(Gln group，G)进行断奶处理，在基础饲粮中添加1%谷氨酰胺，饲料配方同前期研究报道[8]。试验期7 d，仔猪自由饮水和采食，饲养于环境可控的保育室，相对湿度65%～75%，温度(25±1) ℃，每圈配有1个保温箱，使早晚温差不超过3 ℃。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 生长性能

分别于试验开始和结束时，空腹称重，计算试验期平均日增重(average daily gain，ADG)。

1.3.2 血清游离氨基酸及其代谢产物测定

仔猪28日龄时，测量体质量，并从前腔静脉采血，于4 ℃ 3 000 r·min-1离心10 min，将同组2头猪的血清样品等量混合用于消除个体差异，-80 ℃保存用于氨基酸分析[8]。参照文献[9-10]测定血清中的游离氨基酸浓度。将血清样本置于室温下解冻后涡旋混匀15 s，取1 mL血清加入2.5 mL 7.5%三氯乙酸漩涡混匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，取上清液用于游离氨基酸分析，进样量为20 μL。分析周期150 min，柱平衡时间35 min；检测波长570 nm，其中脯氨酸440 nm[11]。

1.4 数据统计分析

仔猪血清游离氨基酸含量采用单因素方差分析(SPSS 18， Chicago， IL， USA)，结果以Mean±SEM表示，P<0.05为显著性水平。多元统计分析采用SIMCA-P软件分析游离氨基酸的数据。为观察断奶后样品聚焦情况，先采用非监督的主成分分析(principal component analysis，PCA)方法，然后采用有监督的偏最小二乘判别分析(principal least-squares discriminant analysis，PLS-DA)方法筛选出主要差异变量，从而找到使断奶后氨基酸代谢谱发生变化最相关的氨基酸，最后采用正交偏最小方差判别分析(orthogonal partial least-square discriminant analysis，O-PLS-DA)对筛选出的重要差异变量进行验证[12]。

2 结果与分析

2.1 不同处理对仔猪生长性能的影响

由表1可知，与哺乳仔猪相比，断奶组和谷氨酰胺组仔猪末质量和平均日增重均显著降低(P<0.05)。在断奶仔猪饲粮中添加1.0%谷氨酰胺后，仔猪平均日增重较断奶组提高28.92%(P<0.05)。

表1 不同处理对仔猪生长性能的影响Table 1 Effects of different treatment on growth performance of piglets

2.2 不同处理对仔猪血清游离氨基酸含量的影响

由表2可知，在必需氨基酸中，断奶组较哺乳组仔猪血清精氨酸、组氨酸和缬氨酸含量显著(P<0.05)降低，分别下降27.66%、34.87%和27.34%；异亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸和苏氨酸含量显著(P<0.05)增加，分别增加9.70%、63.41%、23.27%和60.71%。在非必需氨基酸中，断奶组较哺乳组仔猪血清半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸含量显著(P<0.05)降低，分别下降30.05%、21.09%、50.07%和37.24%；丙氨酸含量显著(P<0.05)增加，增加57.1%。

表2 不同处理对仔猪血清游离氨基酸含量的影响Table 2 Effects of different treatment on plasma free amino acid content of piglets μg·mL-1

当添加谷氨酰胺时，在必需氨基酸中，谷氨酰胺组较断奶组仔猪血清异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸含量分别上升8.15%、8.49%和23.56%(P<0.05)，苏氨酸含量下降24.61%(P<0.05)，其中苏氨酸和缬氨酸含量恢复到哺乳组水平。在非必需氨基酸中，甘氨酸含量下降21.60%(P<0.05)，半胱氨酸含量上升14.08%(P<0.05)。

由表3可知，断奶时在必需氨基酸衍生物中，γ-氨基正丁酸、牛磺酸含量分别下降96.56%、46.92%(P<0.05)；在氨能量代谢中，瓜氨酸含量下降48.38%(P<0.05)，α-氨基己二酸含量上升154.02%(P<0.05)；在硫新陈代谢中，胱硫醚含量上升83.07%(P<0.05)。在其他代谢产物中，肌肽、乙醇胺和羟赖氨酸含量分别下降38.44%、24.71%和74.45%(P<0.05)，鹅肌肽、1-甲基组氨酸、尿素、磷酸乙醇胺和磷酸丝氨酸含量分别上升310.39%、869.05%、19.27%、183.95%和20.39%(P<0.05)。

表3 不同处理对仔猪血清游离氨基酸衍生物和代谢产物含量的影响Table 3 Effects of different treatment on serum free amino acid derivatives and metabolites in piglets μg·mL-1

当添加谷氨酰胺时，在氨能量代谢中，鸟氨酸含量下降33.70%(P<0.05)，α-氨基己二酸含量上升51.69%(P<0.05)；在其他代谢中，鹅肌肽和磷酸乙醇胺含量分别下降57.59%和55.46%(P<0.05)，α-氨基正丁酸、乙醇胺、羟赖氨酸、磷酸丝氨酸和尿素含量分别上升35.73%、24.54%、272.95%、18.29%和51.01%(P<0.05)，其中乙醇胺、羟赖氨酸、鹅肌肽、磷酸乙醇胺含量恢复到哺乳组水平。

2.3 主成分分析

为了使多样品的分析结果更加直观和可视化，且具有统计学意义，本研究首先采用了非监督的PCA方法，对仔猪血清样本进行分组处理。由PCA得分图(图1)可见，试验结束时，3个试验组之间无明显的交叉重叠部分，样品点聚合为3类，即哺乳组、断奶组、谷氨酰胺组，表明3个试验组代谢物的表型存在显著(P<0.05)差异。

S1—S4，哺乳组；W1—W4，断奶组；G1—G4，谷氨酰胺组。S1-S4， Suckling groups; W1-W4， Weaned groups; G1-G4， Gln groups.图1 仔猪血清氨基酸代谢谱PCA得分图Fig.1 PCA score of piglet serum amino acid metabolism spectrum

载荷图中的变量反映了不同游离氨基酸对样品判别的贡献率及变量之间的相关程度，离原点越远，对分组的贡献越大。由图2可见，甘氨酸、α-氨基正丁酸、尿素、鸟氨酸、苏氨酸、乙醇胺、缬氨酸、亮氨酸、胱氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸和羟赖氨酸位于较远处，说明其对样品判别的贡献率较大，被这2个主成分解释得越充分。

图2 仔猪血清氨基酸代谢谱PCA荷载图Fig.2 PCA load diagram of piglet serum amino acid metabolism spectrum

2.4 偏最小二乘法判别分析

PLS-DA是基于PCA模型的一种有监督的分析方法，用于建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大分离，并利用建立的多参数模型对位置的样本进行预测。在本试验中，为了进一步研究早期断奶对仔猪血清氨基酸代谢谱的影响，采用PLS-DA方法对不同处理仔猪血清样本进行重新建模，以找到伴随模型贡献较大的氨基酸，从而从氨基酸代谢物角度进行研究。PLS-DA模型中变量投影重要性(variable importance in the project，VIP)值能够反映变量X和Y之间的相关性，用来选择重要的代谢物。通常VIP大于1时，X与Y之间有较好的相关性。由图3可知，在氨基酸代谢谱PLS-DA模型中，甘氨酸、α-氨基正丁酸、尿素、鸟氨酸、苏氨酸、乙醇胺、缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸和羟赖氨酸是较为重要的氨基酸及其代谢产物。

图3 各氨基酸的变量投影重要性Fig.3 The VIP value of each amino acid in the model

2.5 正交偏最小方差判别分析

正交偏最小方差得分图(OPLS-S-plot)从另一角度反映了PLS模型中的重要变量，离原点越远的变量，其重要性越大。从图4可发现，甘氨酸、α-氨基正丁酸、尿素、鸟氨酸、苏氨酸、乙醇胺、缬氨酸、亮氨酸、胱氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸和羟赖氨酸位于离原点的较远处，与权值VIP排序图(图3)的结果相符合。

图4 正交偏最小方差得分图Fig.4 Orthogonal partial least square score plot

3 讨论

3.1 谷氨酰胺对断奶仔猪生长性能的影响

仔猪断奶后，饲粮由液体转变为固体，由于仔猪消化系统发育尚不完全，脾胃功能低下，消化酶分泌不足，所以容易影响机体对营养物质的消化吸收，造成营养摄入不足。谷氨酰胺具有防止肠道黏膜萎缩、提高机体抗氧化能力、防止肌肉分解、减轻应激反应等功能，本试验结果表明，日粮中添加谷氨酰胺能够显著提高断奶仔猪的平均日增重，说明谷氨酰胺能够有效提高断奶仔猪的生长性能。

3.2 谷氨酰胺对断奶仔猪血清游离氨基酸含量的影响

血液是动物最容易获得的体组织，血液中游离氨基酸(PFAA)常被作为机体氨基酸库，用以研究体内蛋白质代谢状况，估测动物的氨基酸需要量[13]。断奶通常意味着仔猪生存环境和心理的急剧变化，食物类型与摄入模式的剧烈变化。谷氨酰胺通过代谢作用可生成瓜氨酸、鸟氨酸和脯氨酸。谷氨酰胺是哺乳动物细胞快速分裂的必需氨基酸和主要能量底物，以及谷胱甘肽、嘧啶和嘌呤的前体，在肠道健康中起关键作用[14]。氨基酸的失衡通常会导致机体正常生长代谢受阻，甚至引起病理学改变。

从本试验结果可以看出，早期断奶仔猪的血清中多种游离氨基酸含量都有不同程度的变化。血清游离氨基酸浓度在一定程度上可以反映动物体内氨基酸代谢状况[15]，其中血清中精氨酸、组氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和脯氨酸含量在断奶的早期阶段显著降低，苏氨酸、异亮氨酸、苯甲基丙氨酸和蛋氨酸含量显著上升，而谷氨酰胺组与断奶组相比，苏氨酸和甘氨酸含量显著降低，亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸含量显著上升，与肖英平等[9]在先前的研究中的发现相一致。分析原因，由于母猪的乳汁中存在大量的乳糖、蛋白质、氨基酸、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，断奶后仔猪采食量降低，摄入富含氮化合物的全价配合饲料中易于消化吸收的蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质含量较少，从而导致肠道消化吸收的氨基酸含量减少[16]。相关研究也证实，早期断奶应激使小肠绒毛萎缩、隐窝深度增加、消化酶活力下降，从而使进入血液中的氨基酸含量也降低了，同时阻碍了三羧酸循环，这可能是导致血清中氨基酸降低的主要原因。

3.3 谷氨酰胺对断奶仔猪氨基酸代谢产物的影响

谷氨酰胺在线粒体谷氨酰胺酶的作用下水解生成谷氨酸和氨，氨大部分进入门静脉系统，后被肝摄取转化成尿素[17]。本试验结果可以看出，氨基酸的代谢产物中，γ-氨基正丁酸、牛磺酸、瓜氨酸、肌肽、乙醇胺和羟赖氨酸在断奶的早期阶段显著降低，α-氨基己二酸、胱硫醚、鹅肌肽、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、尿素、磷酸乙醇胺和磷酸丝氨酸含量显著上升。而谷氨酰胺组与断奶组相比，仔猪氨基酸代谢产物中鸟氨酸、鹅肌肽和磷酸乙醇胺含量显著降低，α-氨基己二酸、α-氨基正丁酸、肌肽、乙醇胺、羟赖氨酸、磷酸丝氨酸和尿素含量显著上升。Zhu等[18]研究发现，妊娠晚期母猪补饲谷氨酰胺能显著提高仔猪生长性能和影响血清中游离氨基酸及其代谢产物含量。

综上所述，仔猪血液中缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、乙醇胺、羟赖氨酸、鹅肌肽和磷酸乙醇胺含量恢复至哺乳组水平，其中苏氨酸和缬氨酸为必需氨基酸，苏氨酸作为重要的限制性氨基酸，有利于机体氨基酸的平衡和蛋白质的沉积，对仔猪生长性能的提高具有重要作用，同时补充谷氨酰胺可以提高谷氨酰胺代谢相关的氨基酸在血液和其他组织中的利用率[19]。丙氨酸浓度的升高是因为谷氨酰胺在肠上皮细胞中转化为丙氨酸，弥补了猪奶中丙氨酸浓度较低的缺陷[20]。