响应面法优化针叶樱桃总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性研究

杨 志，李文义，，*，高云涛，熊华斌，陈毅坚，杨慧娟

(1.云南民族大学 云南省跨境民族地区生物质资源清洁利用国际联合研究中心，云南 昆明 650500； 2.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500； 3.中国计量大学 标准化学院，浙江 杭州 310018)

针叶樱桃(Acerola cherry)是金虎尾科小灌木果树的果实，原产美洲热带地区，之后引种至印度等热带及亚热带地区。近年来，我国云南、台湾、广东等地也开始大面积种植。针叶樱桃口感美味、维生素C含量丰富且具有观赏性，因而深受消费者喜爱，在食品保健品、化妆品等领域有广阔的市场需求。据分析，每100 g针叶樱桃果实的可食用部分中，维生素C含量高达1 910～2 976 mg，是目前已知维生素C含量最高的果树果实。因此，针叶樱桃有“植物维C果王”之称[1]。值得关注的是，针叶樱桃富含黄酮类营养素，黄酮可提高针叶樱桃中维生素C的吸收和利用率。目前，关于针叶樱桃果实中总黄酮的相关研究报道较少。

黄酮类化合物是广泛存在于某些植物和浆果中的一类天然产物，是植物中最重要的活性成分之一。研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、消炎杀菌、改善血液循环、降低胆固醇等功效[2-5]。本研究采用有机溶剂对针叶樱桃中的总黄酮进行提取，选用毒害作用小且经济的乙醇作为溶剂，参考已有文献确定的提取温度71 ℃、提取时间1.6 h条件下，研究樱桃破碎目数、乙醇体积分数、液料比等因素对黄酮提取率的影响[6-8]，并利用响应面优化法对提取工艺进行优化，之后再进一步探究针叶樱桃果实中总黄酮的抗氧化活性[9-11]，以期为针叶樱桃的开发利用提供相关参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

针叶樱桃果粉，西安瑞盈生物科技有限公司；芦丁(Rutin)标准品，妍谨生物科技有限公司；DPPH，美国Sigma公司；Trolox粉(水溶VE)，合肥博美生物科技有限公司；无水乙醇和AlCl3，云南科仪化玻有限公司；VE标准品，洛阳氚坤化工仪器有限公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

8453紫外可见分光光度计，美国安捷伦公司；SHJ-4恒温水浴锅，慈溪市天东衡器厂；SHZ-DШ循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；FA2004分析天平，上海上平仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总黄酮提取

取一定量针叶樱桃粉末，过筛除杂，71 ℃恒温水浴浸泡提取1.6 h，其他因素控制具体按单因素设计进行实验，所得浸提液用循环水真空泵进行抽滤，得到样品，置于冰箱保鲜储存备用。

1.3.2 总黄酮含量测定

准确称取20 mg芦丁标准品，用纯水溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，置阴凉处备用。分别移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述芦丁标准溶液于6个25 mL的具塞比色管中，分别加入1%的AlCl3溶液5 mL，再用纯水定容至10 mL，在室温下静置25 min。在415 nm吸收波长下，以试剂空白为参比测定吸光度，绘制标准曲线。所得回归方程为y=2.812 5x-0.017 6，R2=0.999 2，线性良好。

取5.0 mL供试品倒入25 mL比色管中，再加入1%的AlCl3溶液5 mL，在415 nm吸收波长下测定吸光度，根据标准曲线计算提取率。

1.3.3 单因素试验

本研究涉及樱桃破碎目数、乙醇体积分数、液料比三个因素对总黄酮提取率的影响，在探讨某个单因素的影响时，固定其余两个参数的数值。设计工艺参数：樱桃破碎目数为30、40、50、60、70；乙醇体积分数为20%、30%、40%、50%、60%；液料比为20、30、40、50。固定参数取值：樱桃破碎目数50，乙醇体积分数40%，液料比30。研究不同提取条件对针叶樱桃总黄酮提取率的影响。

1.3.4 响应面法优化设计

根据优化软件Design Expert(7.0.1)中Box-Behnken的实验方法，以樱桃破碎目数、乙醇体积分数、液料比为相应因素，以针叶樱桃黄酮提取量为响应值，设立三个因素三个水平的响应面分析进行实验设计(表1)。

表1 响应面因素水平及编码Table 1 Factor levels and coding

1.3.5 针叶樱桃总黄酮抗氧化活性测定

针叶樱桃总黄酮对DPPH自由基的清除作用参照文献[12-13]进行测定。用Trolox溶液对DPPH自由基进行测定实验，计算自由基清除率，得线性回归方程：y=274.58x-0.9695，R2=0.992。

再将响应面图等高线分析得到的最佳提取工艺参数作为实验组，设立对照组1(实验参数为：樱桃破碎目数55、乙醇体积分数45%、液料比25)和对照组2(实验参数为：樱桃破碎目数65、乙醇体积分数55%、液料比35)，对提取液进行DPPH自由基测定，得出DPPH自由基当量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013整理汇总实验数据，利用Design Expert(7.0.1)软件进行响应面优化分析，采用Microsoft Excel 2013作图。

2 结果与分析

2. 1 单因素实验

2.1.1 破碎目数对针叶樱桃黄酮提取率的影响

如图1所示，在相同条件下，开始时随着针叶樱桃破碎目数的升高，总黄酮的提取率呈现上升趋势，当樱桃破碎目数为60时提取率最高，之后随着破碎目数的继续增加，提取率开始下降。可能是由于破碎目数的增加，有助于黄酮的溶出；但过度的破碎可能会使针叶樱桃黄酮类衍化物受到破坏。故选取樱桃破碎目数为55～65用于进一步优化实验。

图1 破碎目数对针叶樱桃黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of different mesh number on extraction efficiency of flavonoids of Acerola cherry

2.1.2 液料比对针叶樱桃黄酮提取率的影响

如图2所示，在相同条件下，当溶剂与针叶

图2 液料比对针叶樱桃黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of different liquid-solid ratio on extraction efficiency of flavonoids of Acerola cherry

樱桃的比例比值在20～30时，针叶樱桃中总黄酮的提取率随着比值的增大而提高，之后稍有下降的趋势并趋于平稳。所以，选取溶剂与针叶樱桃的比例为25～35用于进一步优化实验。

2.1.3 乙醇体积分数对针叶樱桃总黄酮提取率的影响

如图3所示，在相同条件下，针叶樱桃总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大逐渐上升，说明乙醇体积分数越高，有助于针叶樱桃中总黄酮的溶出，因而提取效果越好，可以通过适当增加乙醇体积分数来提高针叶樱桃中总黄酮类物质的浸提效率。

图3 乙醇体积分数对针叶樱桃黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol volumn fraction on extraction efficiency of flavonoids of Acerola cherry

2.2 响应面实验结果与优化分析

2.2.1 优化实验结果

响应面分析结果见表2。对表2结果进行多元线性回归和二次项方程拟合，得到的黄酮提取率(y)对樱桃破碎目数(A)、乙醇体积分数(B)和液料比(C)的二次多项式回归方程为y=87.08+0.16A-0.45B-0.45C-0.35AB+0.18AC-0.48BC-5.44A2-5.60B2-5.21C2。方差分析和显著性检验结果如表3所示。

表2 响应面分析结果Table 2 Results of response surface analysis

表3 响应面方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

此外，二次项破碎目数(A2)、乙醇体积分数(B2)和液料比(C2)的P值<0.05对黄酮提取率回归模型有极显著影响，交互项AB、BC、AC的P值>0.05不显著，说明破碎目数(A)、乙醇体积分数(B)和液料比(C)之间的相互作用对针叶樱桃黄酮提取率的影响较弱。

2.2.2 响应面优化及工艺验证

采用优化软件Design Expert(7.0.1)绘制响应面分析图，结果如图4至图6所示。由图4的3D曲面图和等高平面图可知，极值点存在于近圆心处，说明黄酮提取率在适当的樱桃破碎目数和乙醇体积分数下有极大值；响应面的坡度较小且为圆形，说明樱桃破碎目数和乙醇体积分数交互作用的相关性不高，对黄酮提取率影响不明显。

图4 樱桃破碎目数和乙醇体积分数的交互作用对黄酮提取率影响的响应面图Fig.4 Response surface of mesh number and ethanol volumn fraction interaction effects on the extraction of flavonoids

由图5的3D曲面图和等高平面图可知，在圆心的位置可看到有极值点，说明黄酮提取率在适当的樱桃破碎目数和液料比下可得到极大值；响应面的坡度较小且为圆形，说明提取黄酮时，樱桃破碎目数与乙醇体积分数的相关性不显著。

图5 樱桃破碎目数和液料比的交互作用对黄酮提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface of mesh number and liquid-solid ratio interaction effects on the extraction of flavonoids

由图6可知，响应面的极值点存在于圆心处，说明黄酮提取率在适当的乙醇体积分数和液料比下有极大值；响应面的坡度较小且为形状圆形，说明提取黄酮时，液料比与乙醇体积分数的相关性不显著。

图6 乙醇体积分数和液料比的交互作用对黄酮提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface of ethanol volumn fraction and liquid-solid ratio interaction effects on the extraction of flavonoids

结合以上实验结果和分析，在优化条件下，黄酮提取率在预测模型中最佳的工艺条件为：樱桃破碎目数63.13、乙醇体积分数49.71%、液料比为29.85，此时黄酮提取率的预测值为85.07 mg·100g-1。根据最佳工艺条件的参数进行验证实验，为便于开展，改为樱桃破碎目数63、乙醇体积分数50%、液料比为30的条件下，进行3次平行实验，得到的平均黄酮提取率为86.9 mg·100g-1，与预测值大致相符合，说明模型具有较好的预测准确性。

2.3 黄酮提取液抗氧化活性测定

对在樱桃破碎目数63、乙醇体积分数50%、液料比为30的条件下得到的黄酮提取液进行DPPH抗氧化活性测定，得到的DPPH抗氧化平均当量为73.38。如表4所示，用同样的方法进行对照组1(樱桃破碎目数55、乙醇体积分数45%、液料比25)实验，得出的DPPH抗氧化当量为54.83；对照组2(樱桃破碎目数65、乙醇体积分数55%、液料比35)得到的DPPH抗氧化当量为46.83。提取液总黄酮含量越高，得到的DPPH抗氧化当量越高，其抗氧化能力越明显，说明针叶樱桃果实中的黄酮具有较强的抗氧化能力。

表4 黄酮提取液抗氧化活性测定Table 4 Determination of antioxidant activity of flavonoids extracts

3 讨论

本研究选取有机溶剂提取法进行针叶樱桃中总黄酮的提取，通过查阅对比文献及初步实验考查，选用了毒害副作用小且较为经济的乙醇作为溶剂[6-8]，研究了樱桃破碎目数、乙醇体积分数、液料比等因素对黄酮提取率的影响，在单因素实验基础上，利用响应面优化法对提取工艺进行优化，之后再进一步探究了针叶樱桃果实中总黄酮的抗氧化活性。研究得出的最佳工艺条件为：樱桃破碎目数63.13、乙醇体积分数49.71%、液料比29.85，此时黄酮提取率的预测值为85.07 mg·100 g-1。在进行三次平行实验验证后，得到的平均黄酮提取率为86.9 mg·100g-1，与预测值大致相符，说明模型具有较好的预测准确性，响应面分析法可用于优化针叶樱桃总黄酮的提取工艺。

响应面优化分析法以实验得到的数据为基础，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析来优化工艺参数，从而解决多变量的研究问题；具有预测准确、精度高等优点，已有较为广泛的应用[14-17]。

这种通过常规实验方法，结合软件分析来优化目标产物的提取实验参数，可分析自变量对响应变量的影响，能更精准地评价实验提取条件的优劣，并建立可描述实验过程的数学模型[18]。

另外，黄酮类化合物的提取有多种可用方法，除本文使用的有机溶剂提取法以外，还有超声波提取法、压力溶剂萃取法、大孔树脂吸附法、超临界CO2萃取法、酶法提取法等常用方法[8]。因研究内容及时间所限，本文未使用其他方法来研究总黄酮的提取效果，后续可采用多种方法就针叶樱桃中总黄酮的提取进行研究比对，以期筛选出更好的实验方法与工艺方案。同时，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、消炎杀菌、改善血液循环、降低胆固醇等功效[2-5]，对治疗相关疾病有着重要的作用，开发应用潜力巨大[8]，对于黄酮类化合物的提取、性能及应用方面的相关研究应不断深入。