ERIC-PCR技术与MLST技术对30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因分型结果观察

王方，吴新明，王彦，梁伟

连云港市第二人民医院，江苏连云港222000

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)是一种常见的临床致病菌，可导致院内感染和社区获得性感染，老年人、手术患者及长期使用抗生素的患者为肺炎克雷伯杆菌的易感人群[1]。碳青霉烯类抗菌药具有稳定性好、抗菌谱广等优点，是临床治疗肺炎克雷伯菌感染的最有效药物，也是最后一道防线[2, 3]。随着抗生素药物广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌作为一种多重耐药病菌株不断涌现，导致临床上治疗肺炎克雷伯菌感染患者的无效率超过了半数[4]。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌给临床抗感染治疗带来了巨大挑战。对肺炎克雷伯菌进行同源性分析是研究其感染状况、耐药机制以及流行病学研究的重要工具。因此建立快速准确的同源性分析方法极为重要。肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)是根据ERIC的核心序列设计引物，PCR扩增两个ERIC之间序列，不同细菌的ERIC序列在染色体的位置不一样，因此可以根据扩增条带位置和数量来判断是否为同一基因型多位点序列分型。多位点序列分型(MLST)是一种基于管家基因核酸序列测定的细菌分型方法，既适于分子流行病学调查, 也可用于细菌的分子进化研究。目前关于ERIC-PCR、MLST在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌基因分型方面的研究较少。因此，我们分别采用ERIC-PCR和MLST法对30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行基因分型，并比较两种方法的基因分型结果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源、试剂及仪器 选择2017年1月～2018年12月间连云港市第二人民医院分离的30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株标本，主要来源于重症监护室、脑血管外科和呼吸内科等；标本类型分为痰及支气管分泌物(53.3%)、尿液(23.3%)、血液(13.3%)、切口分泌物(10%)。30株菌株中没有同一患者的重复分离株。PCR仪(Applied Biosystems，美国)；电泳仪和凝胶成像仪(北京六一公司)；VITEK-2全自动细菌分析仪(法国生物梅里埃生物有限公司)；DNA Marker 购自天跟生化有限公司；PCR Mix购自LABLEAD；相关扩增引物和测序由杭州有康生物技术有限公司合成。

1.2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药情况观察 采用药敏试验。采用VITEK-2细菌分析仪观察30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株对阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶、头孢唑林、环丙沙星、头孢曲松(菌必治)、头孢替坦、头孢吡肟、庆大霉素、亚胺培南(泰能)、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、复方新诺明、妥布霉素等16种抗菌药物的耐药性，结果根据美国临床实验室标准化研究所2015版标准进行判断。

1.3 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因分型

1.3.1 制备菌株基因组模板 采用煮沸法提取30株菌株的基因组DNA。首先挑取分纯后的2～3个单菌落于含有200 μL无菌水的EP管中混匀，100 ℃加热10 min，12 000 r/min离心10 min，所得上清即可作为后续PCR反应的模板。

1.3.2 碳青霉烯酶基因的扩增 利用PCR技术扩增30株菌株基因组DNA中的碳青霉烯酶基因，包括KPC-2、NDM-1、IMP、VIM、OXA，引物序列参照相关文献设计[5](表1)，由杭州有康生物公司合成。扩增体系为25 μL，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L上游引物和下游引物各加入1 μL、DNA模板2 μL、加无菌超纯水至25 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min。对扩增结果阳性产物进行测序(杭州有康生物公司)，所得序列在NCBI网站上进行Blast比对分析。从而确定碳青霉烯酶耐药基因的分型。

表1 碳青霉烯酶基因的扩增引物序列

1.3.3 基因分型方法

1.3.1 MLST分型方法 肺炎克雷伯菌的7个管家基因序列、引物序列及分型都参照巴斯德研究院的推荐，网址https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html，7个管家基因分别为gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB。PCR反应体系为30 μL，包含15 μL 2×PCR Mix、上引和下引各1.5 μL，2 μL模板 DNA和10 μL无菌超纯水。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min。扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱，从而得到相应的序列型。

1.3.2 ERIC-PCR分型方法 根据肠细菌基因间共有重复序列ERIC设计引物ERIC-F(5’-ATGT AAGCTCCTGGGGATTCAC-3’)、ERIC-R(5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’)。PCR反应体系为20 μL，包含10 μL 2×PCR Mix、ERIC-F和ERIC-R各1 μL，2 μL模板 DNA和6 μL无菌超纯水。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，44 ℃退火1 min，65 ℃延伸4 min，循环30次，最后65 ℃延伸16 min。运用NTSYS软件对ERIC-PCR电泳图进行聚类分析，聚类树状图相似系数(SI)>90%，且无明显条带差异定为同一基因型。

2 结果

2.1 30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对16种抗菌药物的敏感率、中介率及耐药率比较 30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶、头孢唑林、头孢吡肟、亚胺培南(泰能)、和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率均为100%，阿米卡星和复方新诺明的耐药率为76.6%，其他药物的耐药性介于两者之间。结果见表2。

表 2 30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对16种抗菌药物的敏感率、中介率及耐药率比较

2.2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因扩增结果 30株菌株中，25株菌KPC-2基因扩增阳性，2株NDM基因扩增阳性，1株KPC-2、NDM-1基因扩增阳性，2株未检测到碳青霉烯酶基因。

2.3 ERIC-PCR分型结果 ERIC-PCR指纹图谱结果扩增条带清晰，数目为5～12条，产物最长的超过2 000 bp，最短的小于100 bp。根据聚类树状图结果可将30株菌株分为5个谱型，分别为以A型(83.3%，25/30)，B型(6.6%，2/30)、C型(3.3%，1/30)、D型(3.3%，1/30)和E型(3.3%，1/30)。

2.4 MLST分型结果 30株菌分为5种ST序列型，分别ST11(83.3%)、ST76(3.3%)、ST392(3.3%)、ST641(6.6%)和ST1322(3.3%)。在30株菌中ST11型占绝对优势，分布较集中，克隆株相对单一。

2.5 ERIC-PCR与MLST分型结果的比较 30株菌当中的1、2、3、4、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27号在ERIC-PCR分型系统中属于A型，在MLST分型结果当中属于ST11；29、30号菌在两种分型方法当中分别属于B型和ST64；5号菌分别属于C型和ST1322；11号菌分别属于D型和ST392；28号菌分别属于D型和ST64。两种方法对于30株菌的分辨率完全相同。

3 讨论

肺炎克雷伯菌是医院内重要的条件致病菌之一，可引起呼吸系统、血液系统、泌尿系统及消化系统等感染[6]。近年来由于抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌数量逐年增加[7, 8]。在本研究中30株肺炎克雷伯菌的药物敏感性结果显示，包括亚胺培南在内的16种抗菌药物耐药率均大于70%，其中对头孢他啶、头孢唑林、氨苄西林、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南、头孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率可达100%，说明其耐药性非常严重。而我院存在肺炎克雷伯菌感染的患者病死率达到了48.7%，高致死率可能与患者具有基础性疾病或并发症相关。因此，快速准确地进行临床分离菌株的同源性分析，避免院内感染在更大范围内暴发具有的意义。

判断医院内是否发生感染的一种重要的方法就是比较同一时期分离菌株之间的同源性。目前，常用的同源性分析方法有很多，主要包括核糖体分型(Ribotyping)、随机扩增PCR(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、MLST、脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophore，PFGE)和ERIC-PCR等[9, 10]。其中MLST技术是通过扩增细菌基因组中的7个管家基因片段，将获得的序列数据与数据库进行比对，每个管家基因序列都将获得一个唯一的等位基因号，7个等位基因号组合成为唯一的MLST型别[11]。MLST实验结果已经能够标准化和数字化，因此该技术具有较高的分辨率和重复性。是目前国际上公认的最为客观的同源性分析方法[12]。

ERIC-PCR 技术是在90年代开始由sharples和HuIton等建立的一种用于细菌同源性分析的一种技术[13]。该方法根据肠细菌基因间一段高度保守的共有重复序列设计引物，根据扩增所获得的电泳图结果来判断不同菌株之间的同源性[14, 15]。肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)是一段长度为126 bp序列，位于染色体的非编码区，核心区域有一段具有高度保守性的反向重复序列。根据ERIC的核心序列设计引物，采用PCR的方法扩增两个ERIC之间的序列。不同细菌的ERIC 序列在染色体的位置不一样，因此可以根据扩增条带位置和数量来判断是否为同一基因型[16, 17]。该方法具有操作简单、成本低和周期短等优点，适用于大批量样本的流行病学调查[18]。Qing等[19]利用 MLST和ERIC-PCR两种方法对700株大肠杆菌进行了同源性的分析，得出两种方法具有相同的分辨率。苏珊珊等[20]对从重症监护室分离出了16株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌进行基因分型，ERIC-PCR检测为同一型别，MLST结果显示均为ST76型，这表明两种分型方法得出的结果一致。

本研究对分离的30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行ERIC-PCR和MLST基因分型，结果显示ERIC-PCR可以将30株菌分为5个基因型，分别为A～E型，其中以A型为主，占总数的83.3%，其它四种类型共占16.7%。MLST结果表明，30株菌仍可以分为5个基因型，分别为ST11、 ST641、 ST76、ST392和ST1322，其中ST11占83.3%，其它四种类型共占16.7%。本研究中的30株耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌ST分型具有明显的集中分布特点，其中ST11 型占据绝对优势。据报道[21]，ST11 型克隆株主要在中国、韩国、新加坡等亚洲国家流行。而在美国和欧洲等国家耐药的肺炎克雷伯菌主要的流行株为ST258 型[22]。ST11型与ST258型菌株具有很高的同源性，两者仅有tonB这个管家基因序列不同，其余 6 个管家基因序列完全一致。据报道ST258型菌基因组中含有一段特殊的区域，该区域与荚膜多糖的合成有关，可以帮助细菌逃避宿主免疫系统的攻击，从而使其更易传播[23,24]。但是目前关于ST11和ST258如何成为优势克隆株的确切机制仍然不清晰，有待进一步研究。

PCR 扩增结果显示共检测到2种碳青霉烯酶基因，分别为 KPC-2和NDM-1。其中，KPC-2型碳青霉烯酶基因共检出26株，占总数的86.7%，NDM-1型共检出3株，占总数的10%。在中国，blaKPC-2和blaNDM-1基因是肠杆菌科细菌中最主要的耐药性碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-2是肺炎克雷伯菌中最常见的碳青霉烯酶基因[25]。自从 blaKPC-2基因发现以来，各国均有产KPC型耐药性的肺炎克雷伯菌流行的报道，我国多地也报道[26]了产 KPC-2 型肺炎克雷伯菌，并已成为我国肺炎克雷伯菌耐药的最主要原因。

本实验对ERIC -PCR和MIST两种分型方法进行比较，ERIC-PCR得到的5个谱型分别对应MLST的5种ST序列型，因此，可以得出两种分型方法在肺炎克雷伯菌的基因分型中结果一致，表明两者的分辨率相同。30株菌均具有相同的ERIC-PCR型和ST型，说明这两种方法在肺炎克雷伯菌基因分型的分辨率相同。MLST是基于对多个管家基因序列分析的分子分型技术，菌株同源性分析结果更加保守，适用于长时间跨度、大范围的分子流行病学研究。但MLST实验过程中需要对管家基因序列进行测序，价格昂贵，而且工作量大，要推广到每个实验室有一定的难度[27]。而ERIC-PCR具有灵敏度高、分辨率高、稳定性高、重复性好、的特点，又有操作简单、成本低、检测快捷、无需特殊仪器的优势，易于在临床上推广，近年来被广泛应用于细菌鉴定及基因分型研究。

综上所述，30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株均为多重耐药菌。ERIC-PCR与MLST分型用于肺炎克雷伯菌基因分型中分辨率相同，ERIC-PCR具有灵敏度高、分辨率高、稳定性高、重复性好、的特点，又有操作简单、成本低、检测快捷、无需特殊仪器等优点，易于在临床上推广，可用于耐碳青霉烯类肺炎克雷伯军细菌的鉴定及基因分型研究。