副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用

李璐璐，骆延波，张庆，赵效南，任金瑞，2，胡明，张印，齐静，刘玉庆

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所／山东省畜禽疫病防控与繁育重点实验室，山东济南 250100；2.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是存在于猪上呼吸道的一种共栖菌［1］，也是一种条件性致病菌，可以在猪抵抗力较弱或者病毒感染后易感，引起以浆液性或纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的Gläserser病，也称为副猪嗜血杆菌病［2］。副猪嗜血杆菌病多发于保育仔猪和青年猪［3］，严重时死亡率可达50%以上［4］。

目前对于副猪嗜血杆菌的检测主要采用PCR方法，包括普通 PCR［5］、实时 PCR［6］、荧光定量 PCR［7，8］、多重 PCR［9］等。PCR检测的特异性和灵敏性毋庸置疑，但是需要昂贵的PCR扩增仪和凝胶成像系统。Notomi等［10］在2000年发明了一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，针对靶基因序列的6个区域，设计4条引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换作用，在恒温条件下进行高效特异的扩增反应。LAMP技术目前已经用于多种临床常见细菌的鉴定，如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌等［11-13］，以及细菌耐药基因和毒力基因的检测［14，15］。本研究拟采用LAMP技术，建立一种针对Hps的快速检测方法，并对该方法的特异性和灵敏度进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株 大肠杆菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、粪肠球菌（ATCC 29212）、猪链球菌（ATCC 43765），购自中国兽医药品监察所；30份带有明显呼吸道症状的猪肺样品，用于LAMP方法的验证。

1.1.2 试剂与仪器 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），OXOID公司产品；小牛血清，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），Sigma公司产品；脱氧核糖核酸扩增试剂盒（环介导等温扩增法）、LAMP浊度实时分析仪（LA-320C）、荧光目视检测试剂盒（SLP221），荣研生物科技有限公司产品；细菌DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司产品；凝胶成像仪、分光光度计 Nanodrop 2000，美国Bio-rad产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病原菌的分离与基因组DNA的提取

将30份猪肺样品在无菌条件下使用接种环划线接种于TSA培养基（5%小牛血清＋1%的2 μg／mL NAD），37℃恒温培养 20～24 h。在 TSA培养基上挑取针尖大小、边缘整齐、表面光滑湿润、无色近似透明的菌落，再次划线接种于TSA培养基，进行纯培养后，挑取单个疑似菌落接种于TSB培养基（5%小牛血清 ＋1%的 2μg／mL NAD）中，37℃摇床振荡培养18 h后，通过水煮法提取模板DNA。

将纯化后的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌分别划线于TSA培养基，猪链球菌划线于添加5%小牛血清的TSA培养基，37℃恒温培养18～20 h后，挑取单个疑似菌落接种于TSB培养基或添加5%小牛血清的TSB培养基，37℃摇床振荡培养18 h后，按照天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取相关菌株的基因组。

1.3 引物设计

根据GenBank中已发表的Hps 16S rRNA序列，采用Blast获得高度保守区域。针对保守区域序列，根据LAMP引物设计原则，使用蓝谱公司Primer Explorer V5软件 （http：／／primerexplorer.jp／lampv5e／index.html）设计3组引物（分别标记为HP-1L、HP-2L和HP-3L），每组引物均包含一对外引物（F3和B3）和一对内引物（FIP和BIP）。为提高扩增效率，对筛选出的最佳引物组设计一条或两条环引物（LF和LB）。PCR引物序列参考之前的文献报道［5］。

1.4 反应体系的建立

LAMP反应体系（25μL）：2×反应缓冲液（RM）12.5μL，Bst聚合酶 1μL，FIP和 BIP各0.4μL，F3和 B3各 0.1μL，模板 DNA 2.0μL，加ddH2O至25μL。

PCR反应体系（25μL）：2×Taq PCR反应液10μL，16SrRNA-F和16SrRNA-R各1μL，DNA模板2μL，加 ddH2O至25μL。反应程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃ 10 min。

1.5 反应条件的优化

选择Hps 16SrRNA呈阳性的H21菌株作为阳性对照株，进行LAMP反应最佳引物组和最佳反应温度的筛选以及灵敏度、特异性试验。

1.5.1 最佳引物组的筛选 将Hps的16S rRNA的3组引物按上述反应体系分别配置后，65℃恒温反应 60 min后，80℃恒温反应 5 min，根据LAMP浊度仪实时记录的650 nm的浊度值绘制浊度曲线，以最先出现扩增反应并且扩增效率较高的引物组为最佳引物组。选择特异性好的引物组，根据需要设计环引物，再进行特异性验证，从而筛选出最佳引物组。

1.5.2 最佳反应温度的筛选 使用筛选出的最佳引物组，分别于60～67℃扩增60 min，绘制浊度曲线，选择扩增反应最早出现、扩增效率较高的温度为最佳反应温度。

1.6 LAMP灵敏度测试

使用Nanodrop 2000测定H21菌株基因组DNA浓度，然后用灭菌去离子水将模板浓度调至1 ng／μL进行灵敏度试验。继续对 1 ng／μL的DNA进行10倍连续稀释，使用同样的一组DNA模板进行LMAP反应和PCR扩增，比较两种方法的灵敏度。

1.7 LAMP特异性测试

首先使用5株标准菌株和H21进行LAMP反应特异性试验。之后选取30份临床采集的猪肺样品的DNA作为样本，采用LAMP和PCR两种方法进行检测，比较两种方法的符合程度。

1.8 试验结果的判读

1.8.1 LAMP结果判读 包括两种方式：（1）LA-320C仪器每6 s测定一次反应管中的浊度，可根据浊度绘制实时的浊度曲线图［16］。按照实验仪器的说明书，一般浊度＞0.1时，认为反应结果呈阳性。（2）在LAMP反应中，DNA延伸时脱氧核酸三磷酸基质（dNTPs）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，生成一种焦磷酸镁衍生物的白色沉淀物［17］，因此使用肉眼观察是否有白色沉淀，即可判断反应扩增与否。

1.8.2 PCR结果判读 取 PCR产物5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像系统下观察有无条带。

2 结果与分析

2.1 最佳引物组的筛选

以H21基因组DNA为模板，分别以HP-1L、HP-2L和HP-3L为引物，浊度监测60 min并绘制浊度曲线，见图1。相同温度和反应条件下，引物HP-1L和HP-3L出现明显扩增，并且这两组引物出现扩增反应的时间差不多，但HP-1L的扩增效率明显高于HP-3L。对这两组引物组设计环引物，HP-1L引物组可设计出一组环引物（LF和LB），而HP-3L引物组只有一个环引物LB。进行特异性试验后，最终选择HP-1L＋LF＋LB为试验引物组，引物序列见表1。

图1 不同扩增引物下的浊度曲线

表1 LAMP和PCR方法的引物序列

2.2 最佳温度的筛选

以H21基因组DNA为模板，以表1中LAMP序列作为引物，分别在60～67℃进行反应，根据浊度仪实时监测的浊度结果绘制浊度曲线（图2）。当反应温度为64、65、66℃时，最先发生扩增反应。由于64℃时的扩增效率比较高，因此设定64℃为最佳反应温度。

图2 不同温度下的浊度曲线

2.3 LAMP方法的特异性检测

以H21作为阳性对照菌株，ddH2O作为阴性对照，使用5株标准菌株验证LAMP方法的特异性，结果（图3）表明，本研究中建立的 Hps 16SrRNA的LAMP方法具有较高的特异性，可特异性检测Hps。

图3 LAMP特异性试验

2.4 LAMP方法的灵敏度检测

以1 ng／μL的模板DNA为基础进行10倍稀释后，选择1～10-6ng／μL的7个浓度为模板，分别进行LAMP和PCR的扩增。由图4可以看出，LAMP反应的最低检测限为10-4ng／μL，PCR反应的最低检测限也为10-4ng／μL，LAMP方法与PCR的灵敏度相当。由图4 A可以看出，当DNA浓度分别为1 ng／μL和10-4ng／μL时，反应时间分别为22 min和39 min。考虑到样品的复杂性，因此将LAMP方法的反应时间设置为45 min。

2.5 临床样品检测结果

对采集的30份猪肺临床样品进行LAMP检测，结果发现12份结果为阳性；利用常规PCR进行检测，与LAMP结果吻合，证明LAMP方法可在临床样品中特异性检测Hps。

图4 LAMP和PCR反应灵敏度试验

3 讨论与结论

目前针对Hps的PCR鉴定主要使用3个靶基因，分别为16SrRNA基因、infB基因和OMP基因。16SrRNA基因在细菌各种属之间具有高度保守性，被广泛用于细菌之间的种属鉴定。

国内外对Hps快速检测的LAMP方法已有研究。Zhang［18］、Chen［19］等均根据 infB基因建立了Hps的 LAMP方法，两者的检测限分别为10 CFU／mL和 5拷贝／管。魏晓媛［20］根据 OMP P2基因建立了LAMP方法，其检测限为0.2 pg／μL。根据Hps的16S rRNA基因建立的LAMP方法，其检测限为 0.3～0.68 pg［21，22］及 0.2～0.241 pg／μL［23，24］。本试验建立的 LAMP方法灵敏度与PCR方法相当，但比上述方法灵敏。此外，上述LAMP方法的反应时间均在50～65 min，本研究建立的LAMP方法反应时间为39 min，比之前报道的LAMP方法更适用于Hps的快速检测。

LAMP被认为是快速检测核酸的一种方法，具有高特异性和高灵敏度，目前已经广泛应用于人类和动植物中。LAMP方法与PCR方法相比，成本低廉，不需要昂贵的仪器设备，即可使用Bst聚合酶达到快速反应的目的。与传统的检测方法相比，本研究建立的LAMP检测方法具有耗时短、成本低廉、操作简单等优点，尤为适合基层的疫病检测。

目前，全球养猪业受到了Hps的严重威胁，建立及时、准确的检测方法是成功防治该病的关键。本研究建立的LAMP方法为快速鉴定Hps提供了依据。