响应面法优化微波-辅助提取金银花中绿原酸工艺研究

侯敏娜,侯少平,刘艳红,王珊,许海燕,彭修娟

(陕西国际商贸学院, 陕西 咸阳 712046)

金银花(LoniceraJaponica)，又称双花、金花、银花，为忍冬科忍冬属忍冬组植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花[1]。具有清热解毒、消肿止痛的功效[1]，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒和温病发热等症[2～4]。植物中的绿原酸具有抗菌、抗病毒等药理活性，也是金银花中主要成分，也是市售中成药感冒药中含有的成分。随着医学发展的研究，人们对于金银花的理解也越来越深，对金银花的利用程度也随之提高。笔者研究利用微波法从金银花中提取得到的绿原酸工艺，将为金银花药材合理、广泛利用提供实验技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花(购于河南省密县，经我院中药学教研室雷国莲教授鉴定为Lonicerajaponica)；绿原酸标准品(中国药品生物制品检定研究院，批号：110753-201415)；95%EtOH(天津市天力化学试剂有限公司)；NaOH(天津市河东区红岩试剂厂)等，试剂均为市售分析纯。

TU-1810型紫外-可见分光光度计(上海长城制造有限公司)；FA2004A型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；HH-2型恒温水浴锅(江苏金坛市亿通电子有限公司生产)；XH-200A型微波萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；SHZ-D型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；TDL-60B型高速离心机(上海安亭科学仪器厂制造)等。

1.2 实验方法

1.2.1 金银花中绿原酸标准曲线的制作 绿原酸标准溶液的制备 将绿原酸标准品放入恒温干燥箱中，于105℃干燥后常温放凉以备用。准确称取预先处理好的绿原酸标准品0.005 g，先加入少量70%的乙醇使其充分溶解，随后再定容至刻度。分别精密移取上述配置好的标准品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，于用波长为327 nm处的紫外光光下，测各吸光度[5,6]。以吸光度A(y)和浓度C(x)在excel表格中绘作其标准曲线，结果见图1。由图1可知，绿原酸浓度在4～24 mg·mL-1范围内，与吸光度线性关系良好。

1.2.2 金银花中绿原酸提取方法及含量计算 称取100 g金银花清洗，低温烘干，粉碎，过二号筛，封存备用。精确称取2.000 g金银花粉末，于100 mL烧杯中，加入适量一定浓度的乙醇，浸泡10 min，使其充分浸透后，经微波提取后过滤，滤液定容至250 mL容量瓶中。从其中移取2 mL，定容于50 mL容量瓶中。在波长327 nm处，测其吸光度，根据公式，计算，可得绿原酸提取率(Y)[6～8]。

绿原酸提取率(Y)=CVn/1000m×100﹪

其中，C为样品溶液浓度，mg·mL-1；V为体积，mL；n表示样品转为原液的倍数；m表示金银花粉末的量，g[8]。

1.2.3 单因素考察[9～12]精确称取金银花粉末适量，于100 mL烧杯中，加入适量一定浓度的乙醇，浸泡10 min，使其充分浸透后，经微波法提取。通过考察溶液的pH值(3、4、5、6、7)；乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)；料液比(1∶6 g·mL-1、1∶8 g·mL-1、1∶10 g·mL-1、1∶12 g·mL-1、1∶14 g·mL-1)和提取时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)等因素，对金银花中绿原酸提取率(Y)的影响。

1.2.4 响应面实验优化 通过单因素实验考察结果及响应面中心组合的方法，以金银花中绿原酸提取率为响应值(Y)，以溶液的pH值(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)和提取时间(D)为选取的对金银花中绿原酸的提取率(Y)的影响较大的四个因素。每个因素水平分别用-1、0和1表示低、中、高三个水平，设计29组实验。见表1。

表1 实验因素水平

1.2.5 数据处理 采用Design- Expert8.0.6软件分析、处理实验数据。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 溶液的pH值对金银花中绿原酸提取率的影响 由图2可明显看出，PH值在小于5时提取率随着pH值升高而增加，且增加趋势度较快，在曲线上显示为斜率较大；但超过5以后，提取率开始逐渐减小，且pH值为5～6之间下降最大，负斜率超过了增加时的斜率。故选择溶液的pH值等于5时，为金银花中绿原酸提取溶液pH值的最优取值。

2.1.2 乙醇浓度对金银花中绿原酸提取率的影响 由图3可明显看出，横坐标上乙醇浓度分数变大，金银花中的绿原酸提取率在最初先上升随后出现了下降的情况，当达到中值70%的时候，与此对应的绿原酸的提取率达到了该条件下的最大值。当高于70%时呈明显急剧下降趋势，可能是由于乙醇浓度高时引入的杂质比较多或抑制了一部分绿原酸的溶出。故选择70%的乙醇，为提取金银花中绿原酸的最优乙醇浓度取值。

2.1.3 料液比对金银花中绿原酸提取率的影响 由图4可明显看出，随着横坐标上料液比越来越大，金银花中绿原酸提取率越来越高，当料液比小于1∶12 g·mL-1，提取率成正增长趋势；当料液比大于1∶12 g·mL-1时提取率逐渐降低趋势。故选择料液比为1∶12 g·mL-1，为金银花中绿原酸的最优溶剂提取用量取值。

2.1.4 提取时间对金银花中绿原酸提取率的影响 由图5可明显看出，在其他条件恒定不变的情况下，当微波时间为30 min时，提取出的金银花绿原酸量最多，在20 min和30 min之间斜率最大，但提取时间超过30 min后，可能随着时间的增加，绿原酸会部分分解使提取率开始逐渐减小。故选择时间为30 min，为金银花中绿原酸的最优提取时间取值。

2.2 响应面法优化实验结果与分析

2.2.1 二次回归模型方程的建立及方差分析 以金银花中绿原酸提取率(Y)为考察指标，结合单因素实验结果，对溶液pH值(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)和提取时间(D)四个因素对金银花中绿原酸的提取率(Y)的影响，设计29组实验，结果见表2。

表2 响应面设计实验数据

利用Design-Expert8.0.6软件对表2的数据进行统计分析，得到Y(金银花中绿原酸的提取率)与A(溶液的pH值)、B(乙醇浓度)、C(料液比)和D(提取时间)的二次多元回归方程如下：

Y=+9.65+0.17A+0.030B-0.12C+2.979E-003D-0.18AB+0.068AC-0.083AD-0.087BC-0.039BD+0.015C D-0.19A2-0.022B2-0.12C2-0.024D2

表3 方差分析

由表3数据显示，可以明显看出，模型组的P值小于0.0001，说明该回归方程有显著性，同时R2为0.9653，说明了有96.53%的数据合理有效；F=3.16、P=0.1596，大于0.01，代表了失拟项并不显著，说明了方程可以较好的模拟试验内容，且变异系数远小于10%的阈值，说明此回归方程的精度较高。综上所述，可以认为回归方程合理、精确，可以用于预测金银花中绿原酸微波提取工艺、说明实验的可行性。

2.2.2 响应面分析与优化 根据回归分析结果，使用Design-Expert 8.0.6软件绘制出相应的响应面图和等高线图，结果见图6～图9。

根据图6可知，溶液的pH值和料液比都显得很陡峭，这说明pH值和料液比的交互作用对最终结果的影响非常大。从等高线图可知，相对来说料液比对结果的影响更大。由此，可确定溶液的pH值在5.0～5.50和料液比在1∶10～1∶14 g·mL-1范围时，金银花中绿原酸提取率达到了最高水平。

根据图7的分析得出，溶液的pH值以及乙醇浓度的响应面曲线均比较尖锐，说明溶液的pH值和乙醇浓度对金银花中绿原酸提取率影响均比较大。且乙醇浓度对其影响更大一些。由此，可确定溶液的pH值在5.0～5.50和乙醇的浓度60%～80%范围时，金银花中绿原酸提取率达到了最高水平。

由图8可知，响应面曲线中溶液的pH值和提取时间都显得很陡峭，说明溶液pH值和提取时间的交互作用对最终结果的影响非常大。由等高线图分析，可知提取时间其影响更为明显一些。由此，可确定溶液的pH值在5.0～5.50和提取时间在20～35 min范围时，金银花中绿原酸提取率达到了最高水平。

由图9响应面图可以明显看出，乙醇浓度和料液比的曲面都比较陡，说明乙醇浓度和料液比对金银花中绿原酸提取率影响均较大，且料液比的影响更为显著一些。由此，可确定乙醇浓度在60%～80%和料液比在1∶10～1∶14 g·mL-1范围时，金银花中绿原酸提取率达到了最高水平。

经求导得出最优工艺，即溶液的pH=5.03，提取时间20 min，乙醇的浓度80%，料液比1∶10.11 g·mL-1时，金银花中绿原酸提取率预测值为9.77285%。

2.3 工艺验证

综合考虑操作的可行性，在对最优结果进行验证时，将实验各因素修正为：溶液的pH值=5.0，提取时间20 min，乙醇浓度80%，料液比1∶10 g·mL-1。基于修正过的数据，开展三次平行验证试验。称取2.00 g的金银花粉末, 按照上述最优结果进行微波辅助提取, 平行操作三次，按“1.2.2” 项下方法测定金银花中绿原酸的提取率(结果见表4)，经计算可得其实际得率为9.77266%，与理论值相差0.00019%，说明响应面法得出的试验条件具有很高的可靠性。

表4 工艺验证结果

3 结论

笔者研究了微波法提取金银花中绿原酸工艺。通过单因素实验考察，以金银花中绿原酸提取率为响应值，结合响应面法四因素三水平，共设计了29组实验。综合考虑把修正后实验因素，经三次平行操作验证，得到的最佳提取工艺参数为，即溶液的pH=5、乙醇浓度为80%，料液比为1∶10 g·mL-1，提取时间为20 min时，金银花中绿原酸实际提取率为9.772 66%，与预测值9.772 85%，相差很小。说明该方法可行、可用于金银花中绿原酸提取。通过笔者试验研究可以为金银花中药材临床合理、有效、广泛利用，提供了实验技术支持。