流式细胞术应用及植物种质资源倍性研究进展

宋云连，张惠云，王跃全，高贤玉，左艳秀，罗心平

(云南省农业科学院 热带亚热带经济作物研究所，云南 保山 678000)

前言

植物种质资源(Plant germplasm resourse)是指凡携带有不同种质(基因)的各种栽培植物及其近缘种和野生种。它大多数存在于特定品种之中，如古老的地方品种、新培育的推广品种、重要的遗传材料以及野生近缘植物等。这些资源是经过长时间的自然演变形成的，蕴藏着丰富的潜在可利用基因，但在过去，人们对植物种质资源无太多关注。因此，植物种质资源的保护开发利用与创新在遗传育种中具有十分重要的作用，而其倍性的鉴定则是了解其遗传背景和进一步应用的基础，大量的研究表明，流式细胞术是目前可以高效快速准确的鉴定植物种质倍性的一种技术，是一种应用流式细胞仪进行分析、分选的方法[1,2]。目前，流式细胞仪应用已涉及医学领域，如：常规免疫表型血细胞监测、白细胞计数和小概率细胞分析等；生物学领域，如：微生物活体或死体分析、发酵控制和细胞DNA含量计数等。由于种质资源染色体倍性数据是新品种选育必要的基础数据和遗传背景,且在植物种质资源鉴定和开发利用工作中的应用还很少。因此，本文对流式细胞仪的操作流程、特点、应用领域及其在植物种质资源上的应用进展作了综述[3]。

1 流式细胞仪

1.1 简介

流式细胞仪(Flow cytometry)是对细胞进行自动分析和分选的装置。20世纪60年代后迅速发展起来，至80年代，流式细胞仪进入商品化时期，90年代则进入产品优化阶段，各项功能逐渐强大，人们进行科学研究时也开始涉及流式细胞仪的应用。流式细胞仪利用光学检测系统对高速流动的单细胞悬浮液进行多参数测量和信号处理得到的DNA 含量分布曲线，可以直接观测植物倍性，且具有高效率、 高灵敏度、高分辨率和高精确度的特点，检测一个样品只需几分钟，破坏性小，只要几微克的组织便可进行样品分析，操作技术简单，快速，而且能区分混倍体[4]。

1.2 特点

流式细胞仪与普通生物显微镜不同，在细胞分选以及倍性鉴定方面具有明显的特征和优势，如表1所示：

表1 流式细胞仪与普通显微镜倍性鉴定优势比较

1.3 操作流程

流式细胞仪简单易操作，待测样品的制备只需几分钟，检测结果也只需几分钟就可以清楚的看到。具体操作流程如图1所示：

1.4 应用领域

1.4.1 医学 王琪等应用流式细胞仪对患者的淋巴细胞亚群相对与绝对数量进行了检测，发现CD4+T淋巴细胞平均数量较高,免疫功能损伤程度较低。这项检测有助于今早发现HIV感染者，更好的把握治疗最佳时机，提高生存的质量[5]。苏密龙等应用流式细胞术对多发性骨髓瘤患者的中骨髓细胞表面免疫表型特征进行了检测。研究表明，通过骨髓瘤细胞免疫表型可鉴别骨瘤细胞和正常细胞,这对今后快速，准确诊断骨瘤细胞提供了重要手段[6]。闫彬等应用流式细胞仪中流式微球法检测血浆血管性血友病因子活性,及其对缺血性脑卒中(IS)预后评估。研究结果显示，脑卒中患vWF:GPIbR与vWF:Ag、超敏CRP、Autar评分和住院天数呈正相关。与ELISA法相比,该方法简单可靠，特异度高，准确性高，并且还可以预测脑卒中患者形成脑血栓的风险，评估预后[7]。Polat G等应用流式细胞仪，确定了镰状红细胞(RBCs)患者在不同时间暴露在低氧环境下时红细胞的形态变化。与普通显微镜相比，可以对大量的细胞进行快速的评估以及给出镰状红细胞的动态变化过程，并针对这些统计相关信息，提出相应的治疗手段，这样就可以有效的提高镰状红细胞患者的生活质量[8]。Liran B.Y等通过流式细胞术(IFC)来监测变化感染Mimivirus的棘阿米巴多噬菌体细胞，评估氧化应激和细胞骨架干扰物对病毒感染的影响。研究发现轻度氧化应激可以延缓产生病毒的多个阶段，但发生感染的频率大致相同。另外，还发现功能肌动蛋白细胞骨架需要融合病毒复制中心，才能产生病毒后代。为研究病毒感染周期和病毒-宿主相互作用提供了一种定量、高通量和高度可靠的方法[9]。Vijaya K应用流式细胞仪确定原发性免疫缺陷(PID)或先天免疫缺陷影响表型免疫系统的一个或多个组成部分。其表面、细胞内和核内的蛋白质都可以通过流式细胞术进行评估鉴定，在遗传分析PIDs中，可以快速、准确的诊断。并且成本相对较低，在医学研究中具有重要的应用价值[10]。

1.4.2 生物学 Shashanka S等对应用流式细胞术提高产油微生物在生物处理中的作用，以及流式细胞术在产油微生物方面取得的进展进行了综述。通过大量前人的研究结果说明，在各种高通量筛选细胞的方法中，流式细胞术可操作性最好，还可以实现同时测量单个细胞水平上的生理特征和特定化合物的积累，且有希望从群体中分离出具有特定表型的细胞[11]。陈哲等通过流式细胞仪和 SCoT 分子标记分别鉴定了 14 种荔枝品种的基因组大小及亲缘关系，流式细胞仪测定结果显示‘晚浦’、‘怀枝’和‘白糖罂’和‘井岗红糯’基因组大小相近，荔枝品种间亲缘关系与嫁接亲和性具有一定的相关性。该研究将为荔枝砧木的筛选及嫁接亲和力早期鉴定提供理论依据[12]。李雯雯等应用流式细胞仪对野杏的细胞倍性和DNA含量进行了鉴定，结果发现供试野杏均为二倍体；该研究还筛选出了最适合杏的解离液——MgSO4-LB01混合液。为杏属植物基因组学和遗传进化研究提供基础数据[13]。王婷婷等通过比较离心和不离心，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对流式细胞仪检测结果的影响。结果表明，离心的悬浮液中目的细胞比不离心的悬浮液中目的细胞少；染料DAPI与PI的染色效果无明显差异。根据上述结果，初步建立起一套利用流式细胞术鉴定马铃薯倍性的方法，该方法样品需求量小，步骤简单，快速准确，是鉴定马铃薯染色体倍性的理想方法[14]。罗智等应用流式细胞仪分析了‘冬枣’的5个自然变异材料，结果显示，5个自然变异材料均为二倍体，同时评价了其果实形态、果实营养、物候期以及 DNA 指纹，发现变异1号属于优良大果变异，变异3、4、5号为晚熟变异。这项研究为今后‘冬枣’遗传育种工作提供了理论基础[15]。陈敏敏等采用流式细胞仪鉴定了百合的倍性，同时发现采用Kiwifruit buffer 解离液解离、400 目滤膜过滤,并进行 1 次离心后流式细胞仪鉴定百合倍性的结果更加精准，且应用优化后的流式细胞术快速的鉴定出了百合的四倍体，这项研究为百合倍性研究提供了理论基础[16]。吉乃喆等利用流式细胞术结合染色体压片对后代进行倍性检测，得到三倍体。结果显示，‘春水绿波’、‘羽士妆’不仅可以作为亲本或者中间材料将其中的一些优质基因传递到现代基因库中，而且还为后续三倍性育种研究提供理论基础[17]。

2 流式细胞仪在植物种质鉴定上的应用

植物种质资源是极其珍贵的农业遗产与自然资源。如今，自然资源减少，生态环境破坏以及新品种及杂交种不断推广，古老品种逐渐被替代，导致某些重要遗传资源濒临消失。一旦环境气候发生变化，或者出现新病害和虫害，大面积推广新品种地区将会面临毁灭性的损失。人们已经意识到植物种质资源逐渐流失后带来的严重影响，特别是在植物育种工作中，如果没有相应的种质资源，就无法实现突破性成就。随着流式细胞仪功能的不断完善，其用途也越来越广泛。目前，应用流式细胞术快速鉴定植物种质资源的倍性，为植物种质资源的保护及后期育种打下了基础。

闫东玲等应用流式细胞术检测了东北地区 6 种主要越桔属(Vaccinium)植物的染色体倍性，结果发现有3种为四倍体，分别是笃斯越桔、红豆越桔和朝鲜越桔；2种为二倍体，高山笃斯越桔和小果蔓越桔；1种为六倍体，大果蔓越桔。该研究将为中国越桔属植物资源的遗传学评价以及种质资源开发利用等提供重要的科学依据[18]。许蕾等采用流式细胞术，鉴定了鸭茅染色体倍性，鸭茅遗传背景研究及多倍体材料的创制提供技术支撑，加快育种进度，鸭茅遗传背景研究和种质资源利用建立依据，同时为远缘杂交及多倍体育种提供便利。[19,20]田路明等采用流式细胞仪鉴定了21种梨种质资源的倍性，结果新发现了9份三倍体种质，分别为‘细皮梨’‘黑酸梨’‘冀蜜梨’‘世纪梨’‘敦煌香水梨’‘Beure Bosk’ ‘William Laspave’‘Yakumo’‘Butirra Rosata’；为梨种质资源的创新和开发利用提供参考[21]。闫蕊等采用流式细胞仪鉴定了97份油茶种质资源的染色体倍性，结果表明，其中倍性为二倍体的有29 份，倍性为四倍体的有58 份，倍性为六倍体的有9 份；并结合了SSR-PAGE 和 SSRseq方法，校正了8个二倍体为四倍体。该研究发现将三种技术结合能快速准确的鉴定出多倍体植物的倍性，为油茶种质资源的充分利用提供了理论基础[22]。李伟强等采用流式细胞仪对8 份三倍体候选种质材料进行倍性鉴定，发现编号为 1346 的种质材料为三倍体，其余 7 份种质材料疑似为非整倍体。这为今后大量筛选多倍体种质资源提供了重要依据[23]。闫佼利用流式细胞术完成了183份栽培香蕉和野生香蕉以及杂交后代的倍性分析，有69个二倍体,91个三倍体,23个四倍体，为品种选育工作提供分子鉴定依据。也通过实验发现,利用IRAP可以进一步研究香蕉种质资源的遗传多样性[24]。

朱敏等研究利用流式细胞仪分别测定鸢尾、射干和巴西鸢尾新鲜叶片的基因组大小。研究表明：3种鸢尾科药用植物的基因组较为复杂，射干属和鸢尾属基因组相差较大，同属植物鸢尾和巴西鸢尾的基因组大小差异较小。通过该项研究，为传统药用植物射干属和鸢尾属种质资源、品种鉴定和基因组研究提供参考[25]。谢卓宓等通过对比研究，通过流式细胞仪鉴定了9种金线莲种质均为4倍体，且相互的亲缘关系也较近。这为为进一步大范围开展金线莲不同遗传资源亲缘关系研究提供了技术依据，同时，也为金线莲的优良资源筛选和品种鉴定奠定基础[26]。吕顺利用 FCM 技术分析 169 份香蕉种质资源及杂交后代的倍性，为香蕉的遗传进化、系统分类研究以及香蕉的杂交育种提供基础[27]。张燕梅等利用流式细胞术与常规检测方法相结合，检测了25份剑麻种质资源的倍性及农艺性状，研究结果显示，二倍体14份，三倍体2份，四倍体5份，五倍体2份，粤西 75、六倍体1份，混倍体1份。且不同种质资源的农艺性状存在显著差异。该研究为剑麻种质资源的鉴定、保存和推广应用提供参考，为剑麻杂交育种提供理论依据[2]。郭计华等利用流式细胞术对11份香蕉种质资源进行分析，从细胞学层面上揭示了不同基因组类型香蕉种质的真实倍性。这种方法不仅能更好地反映香蕉种质资源之间的遗传特征，而且还可以为今后香蕉种质的基因组学、物种分类以及种群进化等相关研究提供支撑[28]。刘昔辉等利用流式细胞仪鉴定了甘蔗及其近缘属的倍性。结果表明，倍性最低的为芒属的芒，其倍性为 1.4；倍性最高的是印度种的盘沙鞋，为 16.8，说明甘蔗是一种遗传背景复杂的非整倍体植物。该研究结果可用于指导甘蔗杂交组合的配置，能够有效的开发利用其种质资源[29]。王磊利用流式细胞仪测定了中国各地63份生姜种质资源的倍性，在此基础上，建立了生姜细胞悬浮系等生物育种技术体系，为创新生姜种质材料和新品种的选育提供有力的保证[30]。张靖国等采用流式细胞术较为系统全面地对国家果树种质武昌砂梨圃中收集保存的466份砂梨种质进行倍性鉴定, 明晰了中国砂梨基于染色体水平的多样性,为砂梨多倍体育种和起源进化等研究提供依据[31]。

Burson B.L等采用流式细胞术测定了568份黄樟草种质资源，研究表明，308份是四倍体，139份是五倍体，20份是六倍体，2份是七倍体，99份为非整倍体。该研究不仅明确了568份黄樟草种质资源的倍性，而且还为今后黄樟草种质的创新及开发利用提供了理论基础[32]。Tian L利用流式细胞仪对毛里求斯的相关种质资源进行了倍性检测，并建立了一套可靠的SSR标记物。结果显示，毛里求斯种质资源的遗传关系与地理起源基本一致，也为为毛里求斯茅属植物的品种鉴定和遗传多样性、多倍体化和驯化提供新的理论依据[33]。Postman J等利用流式细胞术是对1284份基因库的梨种质幼叶组织进行倍性鉴定，研究发现其中有一个欧洲品种是四倍体，有三个亚洲品种是三倍体。这项研究明确了梨种质的倍性，不仅可以有效的帮助种植者避免使用三倍体不育花粉，有效的提高了育种的效率，而且还有助于该种质资源遗传图谱的建立以及今后的开发利用[34]。Metin T溴草种质资源的DNA含量和倍性测定通过流式细胞术,用普通二倍体做对照，测定发现不同倍性水平的溴草种质资源[35]。Brummer等流式细胞术测定紫花苜蓿种质资源的倍性，研究结果发现，20分之三紫花苜蓿属二倍体。并且通过流式细胞仪确定了之前采用根尖染色体计数评估倍性存在一些不准确性，说明了流式细胞仪比根尖染色体计数法更快捷、更准确，为植物种质资源倍性研究人员提供了有力、可靠的技术支撑[36]。

3 结语

近年来，随着流式细胞仪组件的不断更新，染色剂的不断改进，流式细胞术已逐步应用于多个科学研究领域，可检测指标逐渐增多，在植物倍性鉴定等方法上则具有其他技术不可替代的优势。由于流式细胞仪检测的指标对应的试验方法各不相同，需要注意的事项也存在差异，因此，笔者所提供的试验流程仅适用于检测植物的倍性、DNA含量等生物信息。为此，今后在进行植物科学试验时，针对待测样品需要，设计相应的试验方法，还需要不断地实践总结，积累经验。总之，随着相关研究的不断深入，流式细胞术涉及到的试验方法也会越来越成熟，应用范围也会越来越广泛，检测结果也会更加准确。