大枣煅制前后主要活性成分含量变化研究

刘世军，杨 锐，张 娱，宋忠兴，崔春利，许洪波，刘红波，张军武，王少程

(陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心/秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育)/陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083)

大枣为鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果实[1]。具有补中益气，养血安神，缓和药性的功效。现代药理研究表明大枣中所含的黄酮类化合物具有明显的降压、催眠和镇静作用；三萜类化合物具有抗肿瘤作用；生物碱类化合物也有良好的镇静催眠作用；多糖具有免疫调节、抗衰老、补血等生理活性；而环磷酸腺苷则能增强心肌收缩力、减轻疲劳[2, 3]。关于大枣的炮制方法具史料记载，有擘破，蒸制，炒制，而对煅制研究较少。由于大枣煅制之后可产生止血，收敛作用[4]，故课题组对大枣煅制后主要化学成分的变化进行研究，为揭示大枣煅制炮制原理提供一定的帮助。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

浓盐酸(西安三浦化学试剂有限公司)、甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、碳酸钠、甲醇、亚硝酸钠、冰醋酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、高氯酸、石油醚、Folin试剂、甲苯(分析纯，天津市天力化学科技有限公司)、硝酸铝(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)、无水乙醇(分析纯，安徽安特食品股份有限公司)；对照品：芦丁(16122801)、齐墩果酸(16051205)(陕西乐博生化科技有限公司)、没食子酸(B20851)、莲心碱(B20730)(上海源叶生物科技有限公司)。

1.2 仪器

岛津UV-2600紫外可见分光光度仪(日本岛津公司)、101型电热鼓风干燥箱、MH-500调温型电热套、KSW型电炉温度控制器、KSW箱式电阻炉、DZKW-4电子恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)、FA2004B电子分析天平(上海佑科仪器仪表有限公司)、FW-400AD高速万能粉碎机(天津鑫博得仪器有限公司)、KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、C21-HT2109多功能电磁炉(广东美的生活电器制造有限公司)、WFH-201B紫外透射反射仪(上海精科实业有限公司)。

2 方法

样品制备：将0.5 g准确称取的大枣样品转入50 mL离心管中，再分别加入80 %甲醇溶液5 mL，超声提取(1 000 W)30 min，离心(4 000 r·min-1)10 min后收集上清液，残渣以同样方法再提取1次，合并两次提取液，用80 %甲醇定容至10 mL。4 ℃冷藏备用[5]。

2.1 总酚含量的测定[6]

标准曲线的绘制：精密称取1 mg没食子酸对照品，用蒸馏水定容至10 mL，得标准液(浓度为0.1 mg·mL-1)，分别准确量取上述标准液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 ml容量瓶中，加蒸馏水6 mL，摇匀后加0.5 mL Folin酚试剂，摇匀，过1 min后加1.5 mL 20 %的Na2CO3溶液(质量分数)，混匀定容，在75 ℃恒温水浴反应10分钟，取出冷却后，在760 nm波长处测定其吸光度。得标准曲线方程y=59.071x+0.0041，R2=0.9965。

测样品定：准确移取大枣生品和扣锅煅制大枣甲醇提取液(表1)，分别加入稀释1倍的Folin酚试剂0.5 mL，混匀后再加入1.5 mL 10 %的Na2CO3溶液(质量分数)，然后用蒸馏水定容至10 mL，混匀，75 ℃恒温水浴反应10 min，取出冷却，在760 nm波长处测定其吸光值。

表1 样品中总酚含量测定

2.2 总黄酮含量测定

标准曲线的绘制：准确称取芦丁对照品2 mg，用80 %甲醇溶液溶解并定容至10 mL，即得芦丁标准液(0.2 mg·mL-1)，吸取芦丁标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别置于10 mL的容量瓶中，用80 %甲醇溶液补至5.0 mL，然后加入0.3 mL 5 %的NaNO2溶液，摇匀，放置6 min后，再加入0.3 mL 10 %的Al(NO3)3溶液摇匀，6 min后加入4 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，混匀，用80 %甲醇溶液定容至10 mL，摇匀，10 min后在510 nm波长处测定吸光度[7]，得标准曲线方程y=13.234x-0.0025，R2=0.9994。

样品测定：准确移取大枣生品和扣锅煅制大枣甲醇提取液(表2)于10 mL的容量瓶中，将扣锅煅制大枣甲醇提取液浓缩至5 mL，然后分别加入0.3 mL 5 %的NaNO2溶液，摇匀，放置6 min后加入0.3 mL 10 %的Al(NO3)3溶液，摇匀，6 min后加入4 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，混匀，用80 %甲醇溶液定容至10 mL，摇匀，10 min后在510 nm波长处测定吸光度。

表2 样品中总黄酮含量测定

2.3 总三萜含量的测定

标准曲线的绘制：精确称取齐墩果酸对照品1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得对照品溶液(0.1 mg·mL-1)。准确吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，水浴挥去溶剂后，加入0.4 mL 5 %的香草醛冰醋酸溶液，1.6 mL高氯酸试剂，混匀后于70 ℃水浴加热反应15 min，冷却至室温，加乙酸乙酯定容至刻度线，摇匀，在560 nm波长处测定吸光度[5]，得标准曲线方程y=92.243x-0.0137，R2=0.9988。

样品测定：移取大枣生品和扣锅煅制大枣甲醇提取液(表3)于10 mL容量瓶中[8]，稀释至刻线，取1 mL水浴挥去溶剂后，加入0.4 mL 5 %的香草醛冰醋酸溶液，1.6 mL高氯酸试剂，混匀后于70 ℃水浴加热反应15 min，冷却至室温，加乙酸乙酯定容至刻度线，摇匀后在560 nm波长处测定吸光度[5]。

表3 样品中总三萜含量测定

2.4 总生物碱含量测定

标准曲线的绘制：精密称取2 mg莲心碱对照品至10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解定容[8]，得标准对照品溶液(0.2 mg·mL-1)。分别量取0.0、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4 mL于10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，于282 nm波长处测定吸光度，得标准曲线方程y=11.321x-0.0053，R2=0.9988。

样品制备：配制1 %盐酸溶液250 mL，1 %氢氧化钠溶液300 mL备用。分别称取各样品0.5 g于离心管中，并贴好标签。向每个离心管中分别加入10 mL的1 %盐酸溶液，调节pH=2，浸泡2 h，使生物碱都形成生物碱盐溶于酸水中。每个离心管中分别加入1%氢氧化钠溶液，调节pH为9～10，使生物碱游离出来。分别加入无水乙醇15 mL，封住盖，超声处理40 min，取出离心管，准备下一步处理。过滤样品溶液。将经过过滤的溶液用无水乙醇定容到50 mL的容量瓶中贴上标签备用[9～10]。

表4 样品中总生物碱含量测定

样品测定：准确移取陕西和新疆的大枣生品与扣锅煅制大枣样品生物碱提取液(表4)于10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻线，在282 nm波长处测定吸光度。

3 结论

该研究结果表明，煅制大枣总酚、总黄酮、总三萜含量明显要比生品大枣的低，但是扣锅煅大枣(新疆产)较生品大枣总生物碱含量升高。生品陕西产大枣要比新疆产大枣总黄酮、总三萜、总生物碱含量高，但生品陕西产大枣总酚含量比较低。其炮制品的含量也有差别，扣锅煅新疆产大枣总酚、总黄酮、总三萜、总生物碱含量高于扣锅煅陕西产大枣，这可能是因为产地不同，大枣果肉的紧密度和肥薄不同，导致煅制结果出现差异。大枣在煅制过程中，会发生无氧燃烧，一些化学成分在高温条件下遭到破坏，但在扣锅煅后，产生了止血、收敛作用，其机理有待进一步深入研究。