甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子Ⅱ受体介导PEDV感染作用的初步验证

班艳芳，董建国，2，范兰兰，于林洋，刘献辉，张鹏飞，刘燕玲，张乐宜，王磊，宋长绪*

(1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 5106422.信阳农林学院牧医工程学院，河南 信阳 464000)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征[1]。自2010年10月以来，PEDV变异毒株广泛流行于国内不同地区，对2周龄以内仔猪的危害尤为严重，其发病率和死亡率甚至高达90%～100%，严重影响了养猪业的发展，给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失[2-3]。

PEDV为冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的成员，病毒形态呈球形，在粪便中的病毒粒子常呈现多形态，平均直径为130 nm(95～190 nm)[4]。PEDV基因组为单股正链RNA，长度约为28 kb。基因组分别编码S蛋白(纤突蛋白)、M蛋白(膜糖蛋白)、E蛋白(小包膜糖蛋白)、N蛋白(核衣壳蛋白)、16个非结构蛋白(nsp1～nsp16)和ORF3蛋白[5]。其中S蛋白是PEDV主要抗原蛋白，可分为S1和S2结构域，在PEDV入侵过程中，S1结构域与细胞受体相互作用，S2结构域介导病毒与宿主细胞的膜融合过程[3]。鉴定受体是了解病毒的跨种传播、致病机制和制定干预策略的关键，PEDV的受体研究一直为研究者所青睐[6]。目前有文献报道猪氨基肽酶N(pAPN)是PEDV的一个功能性受体[7]。然而也有研究发现，pAPN蛋白仍不能解释PEDV感染中存在的相关理论问题，Vero细胞系常用于PEDV毒株的分离和增殖，但这些细胞并不表达pAPN[8]。这提示PEDV可能不仅仅依赖于pAPN蛋白感染宿主细胞，也可能存在pAPN以外的受体蛋白[9]。近年来的研究发现，pAPN缺失的新生仔猪可预防猪传染性胃肠炎病毒，但对猪流行性腹泻病毒无保护作用，进一步验证了pAPN不是PEDV的受体[10]。

迄今为止，PEDV相关的侵入机制和免疫机理尚未明确，因此，对PEDV受体的研究具有重要的科学意义。有研究发现，甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子Ⅱ受体(M6P/IGF2R，简称M6PR)在人类医学中关于轮状病毒的研究比较多，大多数轮状病毒株需要与不依赖于阳离子的M6PR(CI-M6PR)才能进入细胞[11]。CI-M6PR的胞质外区有一个重复结构，由15个连续的重复组成，每个重复约147个氨基酸[12]。然而在猪等其他动物体的研究却鲜有报道。鉴于此，本试验通过病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)和质谱(MS)技术，初步探索了不依赖于阳离子的M6P/IGF2R对PEDV感染的影响，为进一步研究PEDV感染细胞的机制和防控PED提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细胞和质粒

PEDV GDgh毒株为本实验室保存；猪小肠上皮细胞IPEC-J2、非洲绿猴肾细胞Vero E6为实验室保存；pCMV-PEDV S2-HA质粒为本实验室构建保存；鼠源抗PEDV S1单克隆抗体为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

同源重组试剂盒(Vazyme，南京)；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收纯化试剂盒(Promega，北京)；LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent、LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent 转染试剂、DMEM培养液、胎牛血清、SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System反转录系统、PierceTMBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific，美国)；鼠源抗Flag、HA单克隆抗体(Sigma，德国)；QuickBlockTMWestern一抗稀释液(Beyotime，上海)；组织细胞RNA提取试剂盒(Magen，广州)；Premix PrimesSTAR HS高保真酶(TaKaRa，大连)。

1.1.3 主要仪器

超速离心机(贝克曼Optima XPN-100)；场发射透射电子显微镜(型号为Talos F200S，Thermo Fisher Scientific)；激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)。

1.2 方法

1.2.1 病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA)

取7日龄三元杂交(杜长大)仔猪的新鲜小肠，轻轻刮取上皮黏膜组织，进行蛋白裂解后测定蛋白浓度，制备猪小肠上皮黏膜蛋白。同时制备2块SDS-PAGE，一块转印至PVDF膜，另一块留作分析。小肠上皮黏膜蛋白上样量为80～100μg/孔，进行SDA-PAGE蛋白电泳、转膜，在室温条件下，用含5%脱脂乳的含磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)封闭膜2 h，用含1%脱脂乳的PBS洗涤1次，最后用缓冲液(含1%脱脂乳的PBS,220 mmol/L NaCl)洗涤，将PVDF膜在缓冲液中4 ℃条件下过夜孵育纯化的PEDV(20μg总蛋白质/mL)，未孵育PEDV为空白对照。将PVDF膜清洗3次，用含0.05% Tween-20的PBST孵育PEDV S1单抗，室温孵育3 h，孵育羊抗小鼠二抗，然后曝光。将在PVDF膜上获得的蛋白印迹对应胶条切下转移至EP管，送至华大基因公司进行质谱分析。

1.2.2 重组质粒构建

参照GenBank已发表的Sus scrofa M6P/IGF2R(AF339885.1)基因序列，通过设计引物扩增其胞外区。由于M6P/IGF2R蛋白分子较大，将其分为三段进行扩增，M6P/IGF2R1：1～750 aa，M6P/IGF2R2：678～1546 aa，M6P/IGF2R3：1486～2287 aa，扩增引物见表1。设计同源引物分别扩增M6P/IGF2R 1～3和pCDNA3.1-3×flag载体，采用同源重组试剂，将M6P/IGF2R三段基因克隆于载体pCDNA3.1-3×flag，同源引物见表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。菌落PCR鉴定阳性克隆并送测序，正确阳性克隆进行质粒提取。

表1 用于扩增M6P/IGF2R的引物序列

表2 同源重组引物序列

1.2.3 Western blot

Vero E6细胞接种于6孔培养板，细胞融合达70%～80%时转染，应用LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent将构建好的pcDNA3.1-M6P/IGF2R重组质粒转染细胞，具体转染操作参照说明书，24 h后收样，Western blot分析表达情况。

1.2.4 siRNA干扰试验

IPEC-J2细胞接种于24孔培养板，细胞融合达50%～70%时转染，应用LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent将M6P/IGF2R siRNA和阴性对照NC siRNA(吉玛基因公司合成)转染IPEC-J2细胞。具体转染操作参照公司手册，siRNA转染量为10 pmol/孔。M6P/IGF2R-siRNA正义序列：5′-CCGAGACACCUGUCUGUAATT-3′，反义序列：5′- UUACAGACAGGUGUCUCGGTT-3′。阴性对照NC siRNA正义序列:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染后培养24 h，将细胞收集，进行定时定量PCR(RT-qPCR)检测干扰效果。细胞分别命名为：NC组(转染阴性对照 siRNA)、siRNA干扰组(转染M6P/IGF2R siRNA)。

1.2.5 激光共聚焦试验

Vero E6细胞接种到共聚焦皿中，让细胞贴壁生长，将重组质粒M6P/IGF2R1～3分别和PEDV S2进行共转染，36 h后弃去培养基，PBS漂洗一次；4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS漂洗3次，10 min/次；0.5Triton X-100室温透化15 min，PBS漂洗3次；2%BSA室温封闭30 min，PBS漂洗一次；用一抗稀释液稀释一抗(1∶2 000)，4 ℃过夜孵育；PBS漂洗3次；用PBST稀释荧光标记的二抗，室温孵育1 h，PBS漂洗3次；用DAPI等核酸染料染核，工作浓度为1 μg/mL；PBS漂洗3次，最后在激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.6 病毒吸附试验

Vero E6细胞接种到24孔板中，待细胞长至70%～90%，将构建的M6P/IGF2R1～3重组质粒转染Vero细胞进行过表达；IPEC-J2细胞接种到24孔板中，待细胞长至50%～70%，转染干扰M6P/IGF2R基因的siRNA。转染36 h后将PEDV按照感染比(MOI)=0.1接种分别在4 ℃孵育3 h和37 ℃孵育1 h，在4 ℃孵育时，细胞需提前预冷1 h。孵育完成后，根据试剂盒说明提取细胞RNA，取500 ng RNA进行反转录，进行RT-qPCR检测病毒拷贝数，基因的相对表达量采用2-ΔΔCt。RT-qPCR引物见表3。

表3 用于检测PEDV RNA拷贝数及内参的RT-qPCR引物序列

1.2.7 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.000 1为差异极显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 VOPBA筛选受体相关蛋白

VOPBA结果显示，PEDV附着于分子质量为250～300 kDa的蛋白条带之间，未孵育PEDV的对照组未见反应(图1)。为了鉴定该蛋白，将凝胶中对应的蛋白条带切除，用质谱法(MS)分析肽质量。将质谱数据与蛋白数据库进行比较，在所获得的肽段中，初步筛选到猪M6P/IGF2R，其分子质量与在硝化纤维素膜上检测到的蛋白大小相似。

图1 VOPBA结果

2.2 Western blot分析M6P/IGF2R1～3表达情况

将构建的重组质粒M6P/IGF2R1～3分别转染Vero E6细胞进行Western blot检测，结果如图2所示，条带大小分别为90、104和96 kDa，与预期相符。

图2 重组质粒转染细胞Western blot检测结果

2.3 siRNA干扰M6P/IGF2R表达

IPEC-J2细胞转染干扰M6P/IGF2R的siRNA，收集细胞进行M6P/IGF2R mRNA的RT-qPCR试验，检测干扰效果，如图3所示，与NC组相比，M6P/IGF2R siRNA可显著降低M6P/IGF2R的mRNA表达水平。

注：****表示两组间差异极显著(P<0.000 1)图3 M6P/IGF2R siRNA干扰效果

2.4 激光共聚焦显微镜观察M6P/IGF2R与PEDV在细胞中表达共定位

将构建的M6P/IGF2R1～3重组质粒分别和PEDV S2共转染Vero细胞，转染后36 h固定细胞，进行激光共聚焦试验，结果如图4所示，分别共转染M6P/IGF2R1和PEDV S2、M6P/IGF2R2和PEDV S2以及M6P/IGF2R3和PEDV S2的细胞中均出现特异性绿色荧光和红色荧光，而Mock组细胞没有出现特异性荧光，DAPI的单色图中均可见清晰的细胞核，在Merge合成图中，可见绿色荧光和红色荧光相重叠，表明M6P/IGF2R和PEDV在细胞中表达共定位，这从一个侧面反映了两者之间存在相互作用。

图4 激光共聚焦结果

2.5 M6P/IGF2R对病毒吸附的影响

2.5.1 过表达M6P/IGF2R促进PEDV吸附Vero E6细胞

Vero细胞分别转染M6P/IGF2R1～3重组质粒后，检测PEDV吸附细胞的病毒拷贝数，结果如图5所示，37 ℃条件下转染M6P/IGF2R1～3和M6P/IGF2R123的细胞中，PEDV的含量相比于对照组有显著提高，转染M6P/IGF2R2和转染M6P/IGF2R3的细胞中PEDV含量与对照组相比无显著差异。4 ℃条件下分别转染M6P/IGF2R1～3和共同转染M6P/IGF2R123时，PEDV在Vero E6细胞上吸附的病毒含量相比于对照组均有显著提高，表明M6P/IGF2R有促进PEDV吸附的作用。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示无统计学意义(P>0.05)。下同图5 37 ℃(A)和4 ℃(B)条件下过表达M6P/IGF2R对PEDV吸附的影响

2.5.2 干扰M6P/IGF2R抑制PEDV吸附IPEC-J2细胞

在IPEC-J2细胞中干扰M6P/IGF2R基因表达后，PEDV吸附结果如图6所示，相比对照组，干扰M6P/IGF2R组的PEDV含量在37℃和4℃时均显著降低，表明M6P/IGF2R有促进PEDV吸附的作用。

图6 37 ℃(A)和4 ℃(B)条件下干扰M6P/IGF2R对PEDV吸附的影响

3 讨论

病毒感染细胞的第一步即病毒与细胞膜表面的受体结合，受体决定病毒的组织细胞嗜性，识别与病毒结合的宿主细胞分子将有助于了解病毒的生命周期及其致病机制[13]。M6PRs是一种多功能蛋白，在细胞表面与两种不同的配体结合，即携带蛋白的甘露糖6-磷酸(M6P)和IGF-II[14]，参与调控细胞生长和凋亡[15]。CD-M6PR(结合活性依赖二价离子)和CI-M6PR在疱疹病毒(HSV)1型和2型以及水痘带状疱疹病毒在进入细胞和细胞间传播过程中都起着细胞受体的作用[16]。研究结果表明，细胞中有大量的M6PR，主要分布在反面高尔基体网络(trans-Golgi network，TGN)、早期内吞体、循环中的内吞体、晚期内吞体及质膜，溶酶体中很少或没有M6PR分布。细胞表面和细胞内部的M6PR构成了细胞的M6PR池，细胞表面和细胞内部的M6PR量保持动态平衡，二者可相互转换[17]。

VOPBA试验利用病毒与受体具有高度亲和力的特点和蛋白质转印原理，直接鉴定与病毒结合的细胞膜受体蛋白，是近年来用于细胞膜表面病毒受体研究的重要方法。病毒与宿主细胞表面受体分子的结合是发生病毒侵染细胞的先行条件，病毒在受体的介导下最终进入宿主细胞，从而出现一系列反应[18]。鉴于此，本试验从质谱结果中筛选与VOPBA结果条带大小相符且属于质膜的蛋白来探索潜在的靶分子。

本试验通过VOPBA和质谱筛选到目标蛋白M6P/IGF2R，初步将其胞外区分为3段进行扩增，并构建到pcDNA3.1-3×flag真核表达质粒上。本试验激光共聚焦结果显示，绿色荧光和红色荧光能够重合，表明M6P/IGF2R的3个片段均与PEDV S2蛋白存在共定位现象，说明两者可能存在相互作用。

PEDV引起的病变主要集中在猪的小肠组织，病毒主要在猪小肠上皮细胞内增殖。因此，小肠上皮细胞作为固有层免疫细胞与外环境间的天然屏障构成肠道的第一道免疫防线，但目前在体外培养中，Vero细胞是分离培养PEDV的最适细胞系[19]。本试验选取最适分离培养PEDV的且易于转染的Vero细胞系进行过表达M6P/IGF2R对PEDV吸附的影响试验，选取IPEC-J2宿主细胞进行干扰M6P/IGF2R后验证其对PEDV吸附的影响。结果证实，过表达M6P/IGF2R可以促进PEDV吸附细胞，干扰M6P/IGF2R。可以降低PEDV的细胞吸附，这一结果与Díaz-Salinasa等[20]研究轮状病毒的感染结果一致，所有经转染M6P/IGF2R siRNA的细胞中，病毒的传染性均显著降低30%～60%。由此提示，M6P/IGF2R在PEDV侵入细胞过程中可能起着细胞受体的作用。

综上，本试验通过VOPBA和质谱分析筛选到M6P/IGF2R，激光共聚焦结果显示其与PEDV存在共定位现象；通过过表达和干扰M6P/IGF2R后检测病毒吸附结果证实，M6P/IGF2R能够促进PEDV的吸附。本研究为进一步研究PEDV的受体提供理论参考。